［關鍵詞］ nm23;p53;肺癌

Expression of mutation and significance of tumor metastasis suppressor gene nm23 and p53 in lung cancer

［Key words］ nm23;p53;lung cancer

目前認為腫瘤的發生是細胞內單基因或多基因發生改變決定的，抑癌基因的失活和癌基因的激活是正常細胞轉化為癌細胞的主要原因［1，2］。nm23基因、p53基因是目前發現分布最廣，與腫瘤相關性最高的癌相關基因，它們與肺癌的相關性報道雖較多，但結論不一，且多為單一因素分析。為尋找有助于準確地預測局部腫瘤的進展、分型及預后情況的臨床參照指標，筆者采用PCR-SSCP（polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism）和RT-PCR技術檢測了31例肺癌術后石蠟包埋病理切片中的nm23表達及p53基因外顯子突變情況，并分析其與肺癌發展及預后的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 標本選用浙江省腫瘤醫院胸外科和浙江醫院胸外科1993～2000年肺癌切除、病理蠟塊31例，男12例，女19例，年齡35～80歲，平均63歲。病理：中分化腺癌5例，低分化腺癌24例，乳頭狀腺癌1例，腺泡細胞癌1例。Ⅰa 1例，Ⅰb 2例，Ⅱa 6例，Ⅱb 4例，Ⅲa 18例。按國際聯合抗癌聯盟UICC標準：Tis～T1 9例，T2～T3 14例，T4 8例，另取2例正常肺癌組織蠟塊作為對照。隨訪1～9年。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 取石蠟包埋病理標本，切片5 μm厚，取3～4片標本剪碎置于1.5 ml EP管中，加入二甲苯脫蠟，離心棄上清液，沉淀后依次加入100%、95%、70%乙醇漂洗。加入消化液和蛋白酶K混勻，50 ℃過夜；用蛋白沉淀液沉淀蛋白質，離心，將上清液轉入新的EP管中，加入冷乙醇沉淀DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 PCR擴增 用已定量的DNA樣本進行PCR擴增。所有試劑均采用nm23（RT-PCR用β-actin作為內對照）及p53突變檢測試劑盒。PCR反應總體積為25 μl。PCR擴增程序：p53：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次，用SSCP檢測常規灌制8%聚丙烯酰胺凝膠，取p53擴增產物加入變性上樣緩沖液，95 ℃變性10 min，點樣，120 V電泳3 h，硝酸銀染色，nm23：PCR擴增程序同前，擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。分析結果。

1.2.3 統計學方法 應用SPSS 11.0軟件統計，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 PCR擴增產物鑒定 以β-actin為DNA分子量標準參照，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，31例肺癌標本nm23陽性為12例提示其nm23基因表達。2.2 p53用SSCP分析 在31例肺腺癌病理標本中，在p53基因中第7、第8外顯子分別存在泳動變位的例數是10例、5例，共10例提示其p53基因存在突變。nm23陽性率及p53基因突變率分別為38.7%及48.4%（見圖1、2）。圖1顯示nm23表達情況，N為正常帶，T為腫瘤標本。圖2中，3、4、5帶顯示DNA泳動變位，提示這3例標本p53第8外顯子有堿基改變。

2.3 隨訪 31例均做隨訪，除1例失訪按死亡計算外，隨訪率96.8%。Ⅰa期1例術后未做特殊治療，余30例做術后方案為CAP、MVP、NP、GP 4周期的化療。除1例術后8個月死于腦轉移外，余30例均生存1年以上（見表1）。nm23表達陽性與p53突變與分期、病理分化程度和生存情況的關系（見表2）。雖病例較少，但nm53陽性表達者3年以上生存率較高，與1年生存者相比有統計學上的差異（P＜0.01）。也以早期肺癌表達較高。而p53外顯子的突變卻以分期較晚，病理分化較低，3年以內（含3年）生存者為多，與5年生存者的突變率相比也具有統計學上的差異（P＜0.01）。表1 分期與生存時間關系表2 PCR檢測與臨床資料關系

3 討論

腫瘤轉移是腫瘤患者主要死亡原因之一，腫瘤的發生和轉移是兩個相互關聯又各自獨立的生物學過程，轉移可受自身的轉移基因及轉移抑制基因的調控［3，4］。腫瘤轉移是一個復雜的過程，包括腫瘤細胞運動，浸潤周圍組織，穿透基膜，逃逸免疫反應并在遠離原發部位增殖，形成轉移灶。尋找在轉移過程中起作用的基因，可指導對轉移性腫瘤的診斷和治療策略。為闡明腫瘤發生、發展是一個多基因、多階段的遺傳學改變過程，我們用PCR-SSCP檢測了31例肺癌腫塊存檔石蠟標本中nm23基因表達及p53基因突變情況。發現nm23在肺癌組織中表達較高為38.7%，其陽性表達表現在早期和預后較好者，與病理類型無明顯的相關，本組Ⅲa期者僅有2例表達，而陽性表達的有50%（5/10）生存超過5年。提示nm23的陽性表達與肺腺癌的期別、預后不良呈負相關。也符合該基因在腫瘤的發展和轉移呈負相關的作用［5］；p53抑癌基因突變位點以第7、8外顯子為主，突變率為48.86%。p53基因突變主要發生在細胞分化不良及腫瘤已發生轉移的肺癌標本。本組31例標本中有p53第7外顯子突變的病例有Ⅲa 5例，其中3例均于術后2年內死亡。本研究結果表明，p53突變與肺癌臨床分期和預后不良呈正相關（P＜0.01）。結合以上結果可以看出，提示nm23表達和（或）p53基因突變在腫瘤形成、發展中是早期事件，對控制細胞的增殖、惡性細胞轉化起作用。同時具有nm23表達和（或）p53基因突變是肺癌加速發展與否的信號，應引起臨床重視，可作為判斷肺癌惡性程度及進展情況的有價值的參考指標。所以開展nm23表達合并p53基因突變檢測有助于篩選是否具有轉移潛能的肺癌腫瘤，用于更準確地評估病人預后及轉歸，同時可指導手術后的整體治療方案。腫瘤的發生是多基因協同作用的結果，nm23、p53基因的突變可能通過增加基因變異事件的積累而起作用，并影響著腫瘤發展。因此，只有對多種癌基因、抑癌基因及其他相關因素進行綜合研究才能將我們對腫瘤發生、發展過程的認識提高到一個新階段，本研究有助于肺癌腫瘤在分子水平上進行解釋，其結果展示了癌相關基因研究的臨床應用前景，并為今后發展轉基因治療提供了線索。

［參考文獻］

1 Itahana K，Dimri GP，Hara E，et al.A role for p53 in maintaining and establishing the quiescence growth arrest in human cells.J Biol Chem，2002，277（20）：18206-18214.

2 Murdoch WJ，Van Kirk EA.Steroid hormonal regulation of proliferative，p53 tumor suppressor，and apoptotic responses of sheep ovarian surface epithelial cells.Mol Cell Endocrinol，2002，186（1）：61-67.

3 Devita VT.Cancer principles and practice of oncology.Philadelphia： JB Lippincott Co，1989，98.

4 Yamaguchi A，Urano T，Goi T，et al.Expreeion of nm23-H1 and nm23-H2 protein in hepatoocellular carcinoma.Cancer，1994，73：2280.

5 毛偉敏，高永良，鄭樹.腫瘤轉移相關基因表達與預后關系.浙江腫瘤，1997，3（1）：46-48.