作者：姚煜，田濤，崔潔，趙娜，郭亞煥，南克俊

【摘要】 目的： 探討COX2和VEGF在肝癌多細胞球體（MCS）中的表達與肝癌群集耐藥的關系. 方法： 以liquid overlay技術獲得肝癌HepG2多細胞球體為模型，采用透射電鏡和掃描電鏡比較單層細胞與MCS的形態學差異；采用MTT法和流式細胞技術比較ADM和5FU對單層細胞和MCS的生長抑制率和細胞凋亡率；采用免疫組化和圖像分析技術比較COX2和VEGF在單層細胞和多細胞球體表達的差異. 結果： 與單層細胞相比，多細胞球體細胞間黏附廣泛而緊密，可見中間連接和橋粒連接. 不同濃度的ADM和5FU作用48 h，MCS細胞的生長抑制率和細胞凋亡率均低于單層細胞，差異有統計學意義（P<0.05）. 免疫組化結果顯示，COX2和VEGF在MCS上高表達（P<0.05）. 結論： 肝癌MCS具有群集耐藥性，可能與其高表達COX2和VEGF有關.

【關鍵詞】 肝癌；群集耐藥；環氧化酶2；血管內皮生長因子

0引言

腫瘤細胞出現耐藥現象是腫瘤化療失敗的主要原因之一. 三維細胞培養比平面細胞培養更能反映體內腫瘤的情況［1］. 我們檢測肝癌多細胞球體（multicellular spheroids，MCS）對阿霉素（adriamycin，ADM）和5氟脲嘧啶（5fluorouracil，5FU）的耐藥性以及環氧化酶2（cyclooxygenase2，COX2）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肝癌群集耐藥（multicellular resistance，MCR）中的表達的關系，探討肝癌MCS的耐藥機制.

1材料和方法

1.1材料人肝癌HepG2細胞購自美國ATCC，由本室保存；RPMI 1640培養液購自Gibco公司；噻唑蘭（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；Annexin VFITC試劑盒購自晶美生物公司；COX2鼠抗人mAb和VEGF鼠抗人mAb購自Santa Cruz公司. 透射電鏡（Hitachi，H600）；掃描電鏡（JEOL，JSM840）；高通量多功能微板測試系統（BMG，PolarStar OPTIMA）；流式細胞儀（BD，FALS Calibar）；圖像信號采集與分析系統（Leica，Q550CW）. 細胞平面培養采用常規方法，多細胞球體采用liquid overlay技術獲得［2］，先將20 g/L瓊脂糖0.5 mL在6孔板上鋪一薄層，冷卻后接種HepG2細胞（1×106/L） 2 mL，每48 h半量換液1次，4 d后形成MCS.

1.2方法

1.2.1細胞超微結構觀察取平面細胞和MCS，置于25 g/L戊二醛固定液中4℃固定2 h，10 g/L四氧化鋨固定液4℃后固定2 h，乙醇梯度脫水，置換，切片，噴金后用透射電鏡和掃描電鏡觀察.

1.2.2細胞抑制率的檢測將細胞接種于96孔板中，在不同濃度ADM和5FU作用48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO振蕩5 min，于492 nm波長處檢測每孔A值，以不加藥物組為空白對照，計算細胞抑制率. 細胞抑制率（%）=［(1-實驗組A值)/對照組A值］×100%.

1.2.3細胞凋亡的檢測單層細胞和MCS分別經不同濃度ADM和5FU作用48 h后收集，按照試劑盒說明書加入Annexin VFITC和PI，避光染色15 min后，上機檢測細胞凋亡率.

1.2.4檢測COX2和VEGF的表達單層細胞制作細胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定20 min后備用. MCS 40 g/L多聚甲醛固定1 h后，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片后備用. 根據試劑盒說明進行免疫組化染色，陰性對照用PBS代替一抗. 用Leica Q550cw圖像信號采集與分析系統在統一光強下隨機選擇10個視野（10×20）計算平均灰度值，灰度值越小，陽性染色越強，表明免疫反應性越高.

統計學處理: 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析. 計量指標以x±s表示，用COX2和VEGF的灰度值表示表達強度，組間比較用方差分析，P<0.05有統計學差異.

2結果

2.1單層細胞和MCS的形態學特點單層HepG2細胞貼壁生長，細胞表面有較多的微絨毛樣突起，細胞間隙較大（圖1A），細胞間連接少見，僅見一類似緊密連接樣的結構（圖1B）. MCS懸浮生長，細胞相互聚集并迅速增殖，形成細胞數目不等的球形多細胞聚集體，具有三維的結構特征，于培養后4 d直徑達到200 μm左右(圖1C)，細胞間黏附廣泛而緊密，可見橋粒連接和中間連接（圖1D）.

2.2單層細胞和MCS細胞抑制率的比較MTT實驗結果表明，除0.15625 mg/L組以外，經0.3125，0.625，1.25和2.5 mg/L的ADM作用48 h后，MCS的細胞抑制率低于單層細胞（P<0.05，圖2A）；經6.25，12.5，25，50和100 mg/L的5FU作用48 h后，MCS的細胞抑制率低于單層細胞（P<0.05，圖2B）.

2.3單層細胞和MCS細胞凋亡的比較經0.5，1.0，2.0 mg/L ADM作用48 h后，MCS的細胞凋亡率低于單層細胞（P<0.05，圖3A）；經40和80 mg/L 5FU作用48 h后，MCS的細胞凋亡率低于單層細胞（P<0.05，圖3B）. 在20 mg/L 5FU組兩者的細胞凋亡未見明顯差異.

A: 掃描電鏡下單層細胞形態（×1000）; B: 透射電鏡下單層細胞形態（×3000）; C: 掃描電鏡下MCS形態（×370）;D: 透射電鏡下MCS形態（×60 000）

2.4COX2和VEGF的表達差異COX2和VEGF主要在胞質表達，呈棕黃色顆粒，對表達陽性的樣本進行圖像分析，測平均灰度值作為表達強度的量化指標. 將單層細胞培養成MCS時，COX2和VEGF的表達均增高（P<0.05）：單層細胞COX2的灰度值為190.8±9.4，MCS的平均灰度值為153.9±10.2；單層細胞VEGF的灰度值為207.4±8.8，MCS的灰度值為186.8±13.9. 光鏡下觀察，單層細胞COX2和VEGF僅個別細胞有弱的染色，而MCS大部分細胞有較強的染色（圖4）.

A: COX在單層細胞中的表達; B: COX在MCS中的表達; C: VEGF在單層細胞中的表達; D: VEGF在MCS中的表達.

圖4COX2和VEGF在單層細胞和MCS中的表達×200

3討論

肝癌耐藥是影響化療療效和患者預后的重要原因. 盡管對于腫瘤耐藥的研究，已經有了很大的進展，如MDR基因的發現，但是這些都是平面培養的結果，忽略了腫瘤細胞與細胞之間，細胞與基質之間的相互影響. 多細胞球體在組織結構上與實體瘤相似，體外培養簡單方便，是研究實體瘤的良好模型，MCS的耐藥現象已經在多種腫瘤中得到證實［3］. 本研究表明，將肝癌HepG2細胞三維培養，當細胞相互黏附成為較致密的多細胞球體時，細胞與細胞之間的連接結構明顯增多，細胞間的相互作用增強；同時細胞抑制率、細胞凋亡率的檢測提示其對ADM和5FU產生明顯耐藥. 這些說明我們所建立的肝癌群集耐藥模型是成功的.

目前，已經提出許多機制來解釋MCR［4］：①MCS中細胞具有不均質性，相對靜止狀態細胞的增多，使得對化療敏感的細胞數量減少；②細胞間的黏附作用可以抑制細胞凋亡的發生，從而產生耐藥；③MCS的環境引起的耐藥相關基因的表達. COX2抑制劑可以通過激活死亡受體信號途徑，caspase途徑和線粒體途徑誘導肝癌細胞凋亡［5］.可見COX2的過度表達改變了細胞某些增殖和凋亡相關基因的表達，從而促進了腫瘤惡性行為的發生. Liu等［6］用CoCl2誘導幾種前列腺癌細胞株VEGF表達的上調幅度與COX2的上調幅度基本一致，且選擇性COX2抑制劑NS398可使VEGF的表達受抑，表明COX2的表達和VEGF相關. 研究表明，在白血病細胞中，VEGF可以誘導抗凋亡因子Bcl2的表達，從而抑制凋亡［7］.

在本研究中，COX2和VEGF在MCS中的表達明顯高于單層細胞，提示這可能是導致肝癌HepG2細胞MCR的重要原因之一. 當單層細胞黏附聚集成致密的多細胞球體時，細胞間連接的增多，MCS中心區缺氧的發生，環境因素的改變可能導致了COX2和VEGF表達的增加，從而促進了細胞增殖，抑制了細胞凋亡，參與了MCR的發生.