作者：楊俊泉，高獻書，劉宏俠，韓春

【摘要】 目的：探討Ⅳ期非小細胞肺癌(NSCLC) βⅢtubulin表達與紫杉類化療耐藥性關系. 方法： 回顧性分析75例接受以紫杉類化療的Ⅳ期NSCLC臨床病理資料. 免疫組織化學法檢測腫瘤標本βⅢtubulin蛋白表達，并對化療療效及生存時間進行分析. 結果： βⅢtubulin陽性表達率（≥50%陽性染色細胞）為58.7% (44/75)，與性別、年齡及組織類型無關. 化療有效率（CR+PR）為34.7%，βⅢtubulin高表達患者紫杉類化療有效率低（25.0%)，進展率高(25.0%)，而βⅢtubulin低表達患者化療有效率高（48.9%)，進展率低（6.4%)，P值分別為0.036和0.037. βⅢtubulin高表達者有較短的中位OS（12 mo）和PFS（8 mo），而βⅢtubulin低表達患者有較長的中位總生存期（OS）（15 mo）和無進展生存期（PFS）（11 mo）， P=0.018. 結論： βⅢtubulin高表達NSCLC患者對紫杉類藥物耐藥且預后不良.

【關鍵詞】 非小細胞肺癌；紫杉醇；微管蛋白；抗藥性；免疫組織化學

【Abstract】 AIM: To investigatethe the relationship between the expression of βⅢtubulin protein and chemoresistance to taxane in nonsmall cell lung cancer (NSCLC). METHODS: Seventyfive patients with stage Ⅳ NSCLC treated with taxane were enrolled in this study and their clinical data were analyzed retrospectively. The expression of βⅢtubulin protein in tumor samples was detected by the immunohistochemical methods. The data of therapeutical effect and survival time were collected and analyzed. RESULTS: The βⅢtubulin positive staining rate（≥50% of stained cells） accounted for 58.7% (44/75). There was no correlation between βⅢtubulin positive expression and age， gender， and pathological type. The response rate (CR+PR) was 34.7%. Patients with βⅢtubulin overexpression displayed less response rate and more progression rate to taxane (response rate 25.0%， PD 25.0% in patients with ≥50% of stained cells vs response rate 48.89%， PD 6.5% in patients with <50%， P=0.036 and P=0.037， respectively). Overexpression of βⅢtubulin protein expression was correlated with shorter median overall survival (12 months） and progressionfree survival (8 months)， While a low level of βⅢtubulin protein expression was correlated with longer median overall survival (15 months) and progressionfree survival (11 months)， P=0.018. CONCLUSION: Overexpression of βⅢtubulin in tumor cells is associated with resistance to taxane and a poor prognosis in patients with NSCLC receiving taxane based chemotherapy.

【Keywords】 nonsmall cell lung cancer; paclitaxel; tubulin; drug resistance; immunohistochemistry

0引言

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關死亡原因中占第一位. 非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的80%～85%. Ⅳ期患者約占NSCLC的40%，其5 a生存率約為1%. 紫杉醇和多西紫杉醇等與鉑類聯合的有效率也僅為30%～40%，腫瘤耐藥性的產生是化療失敗的最主要因素. 研究表明，βⅢtubulin表達與紫杉類耐藥密切相關［1］. 國內未見到βⅢtubulin蛋白表達與NSCLC紫杉類耐藥方面研究報道，我們回顧性分析75例Ⅳ期NSCLC的βⅢtubulin蛋白表達，探討其表達與紫杉類化療效的關系.

1對象和方法

1.1對象

唐山市人民醫院200310/200710有完整隨訪資料的Ⅳ期NSCLC患者75例，年齡≤75歲，體力狀況Karnofsky（KPS）評分≥80分. 有標本供病理學檢測. 男49例，女26例，男女比為1.88∶1；中位年齡為58（41～73）歲，≥58歲38例，＜58歲37例；鱗癌39例，腺癌36例. 化療前行嚴格的分期檢查，包括胸部CT，腹部CT或B超，全身骨骼核素掃描，常規檢查心、肺、肝、腎等功能. 化療采用以紫杉類＋DDP聯合化療方案：紫杉醇175 mg/m2 d1，DDP 75mg/m2 d2，每3 wk一療程；多西紫杉醇75 mg/m2，順鉑75 mg/m2，每3 wk一療程；連續2～6次. 病理組織分型按WHO 1998組織學分類標準，分期按1997年國際抗癌連盟(UICC)制訂的標準. 隨訪200710，結果存活11例，死亡64例，生存期從確診日至死亡或200710，以 mo 為時間單位，中位隨訪時間13（4～30）mo. 接受基于紫杉類化療2～6周期，無CR患者，PR 26例（34.7%），總有效率（CR+PR）為34.7%，SD 36例（48.0%），控制率（CR+PR+SD）為82.7%，PD 13例（17.3%）. 中位總生存期為13 mo，中位無進展生存期為9 mo. 一抗兔抗人βⅢtubulin mAb試劑盒購自美國Cell Signal公司，SP免疫組織化學試劑盒購于福州邁新有限公司.

1.2方法

采用SP免疫組化法檢測βⅢtubulin蛋白表達，βⅢtubulin抗體工作濃度均為1∶100，以內皮細胞或神經細胞染色為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，免疫組織化學流程參考Seve等［1-2］進行. 染色結果采用雙盲法閱片判斷，Olympus光學顯微鏡高倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野記數100個細胞. βⅢtubulin主要均勻的位于正常細胞和腫瘤細胞的胞質，呈黃色或棕黃色顆粒，以內皮細胞或神經細胞染色為陽性參考標準. 染色強度0分為無染色，2分為強度至少相當于內皮細胞或神經細胞，2分以上的細胞為陽性細胞. 樣品含<50%的陽性染色細胞為βⅢtubulin (-)即低表達，≥50%陽性染色細胞為βⅢtubulin (+)即高表達. 療效按WHO 實體瘤標準判定分為：CR（complete response，完全緩解），PR（partial response，部分緩解），SD（stable disease，疾病穩定），PD（progression disease，疾病進展）. 近期客觀有效為CR+PR，有效者應1 mo后檢查確認. CR+PR+SD為腫瘤控制. 總生存期（overall survival，OS）為自治療首日至死亡日或失訪日，無進展生存（progression free survival，PFS) 指自治療首日至病變進展日，均以 mo 計.

統計學處理：應用SPSS13.0統計軟件包，蛋白表達與臨床病理指標采用χ2檢驗；兩蛋白表達之間的比較采用Spearman等級相關；預后判斷采用KaplanMeier生存分析、Logrank時序檢驗分析方法；P<0.05為具有統計學意義.

2結果

75例NSCLC組織βⅢtubulin (+)，即高表達率為58.7%(44/75)，其中男性高表達率為61.2%（30/49），女性53.8%（14/26）；鱗癌53.8%（21/39），腺癌63.9%（23/36）；≥58歲68.4%(26/38)，＜58歲48.6%(18/37)；經χ2檢驗，P＞0.05，無統計學意義（圖1A，B）. βⅢtubulin低表達患者有效率為48.9%，而βⅢtubulin高表達有效率為25.0%，差異顯著(P=0.036). βⅢtubulin低表達患者進展率為6.4%，βⅢtubulin高表達者為25.0%，有統計學意義(P=0.037). βⅢtubulin低表達患者中位OS和PFS分別為15和11 mo，而βⅢtubulin高表達者分別為12和8 mo，經Logrank檢驗，有統計學意義（P＜0.05，圖2A，B）.

3討論

化療是晚期NSCLC的主要治療手段，而紫杉類藥物（包括紫杉醇和多西紫杉醇）是NSCLC的常用化療藥物. 紫杉類的耐藥性（包括原發性耐藥和繼發性耐藥）是限制其臨床應用的主要原因之一. 微管(microtubule)是構成細胞骨架的主要成分，由13 條原纖絲縱向排列構成中空的圓柱狀結構，每條原纖絲是tubulin α和β形成的異二聚體組裝成的多聚體. 有研究認為βtubulin基因TUBB突變可能與紫杉類耐藥相關. TUBB突變可能通過兩種機制導致紫杉類藥物的耐藥：①TUBB基因突變影響了tubulin與紫杉類藥物的結合位點，但微管蛋白功能卻不受影響；②TUBB基因突變改變了與微管聚合相關的微管蛋白二聚體的重要區域，削弱了相互作用，導致微管不穩定. 但是，關于TUBB基因突變的繼續研究卻得出了不同的結論. Kelley等［3］通過對25 種NSCLC細胞株和20例原發性NSCLC研究發現，TUBB突變并不常見，先前的關于NSCLC中TUBB基因突變的研究可能是假基因(pseudogenes)共擴增引起的人為現象. 已知的βtubulin假基因分布在同源染色體6和1，8，19染色體上. 所以那種表面上的TUBB突變與耐藥、預后相關的假象可能與腫瘤的非整倍性相關. Mozzetti等［4］用半定量RTPCR，實時定量PCR和定量免疫組織化學法檢測41例晚期卵巢癌，發現紫杉醇耐藥組βⅢtubulin mRNA水平和蛋白蛋白表達顯著增高（P<0.01）. Rosell等［5］用定量PCR法檢測28例接受紫杉醇+卡鉑化療的NSCLC患者石蠟組織中βⅢtubulin mRNA的表達，βⅢtubulin mRNA低水平（cutoff=0.5)組PR為55.6%（5/9），βⅢtubulin mRNA高水平組PR率為9.1%(1/11)，P=0.05. 15例βⅢtubulin mRNA低水平（cutoff=1)患者中位進展時間為6.8 mo，7例高水平患者為4.2 mo. Paradiso等［6］用免疫組織化學法分析70例基于紫杉醇化療的晚期乳腺癌，發現βⅢtubulin蛋白低表達組腫瘤控制（CR+PR+SD）率和進展（PD）率分別為98%和2%，而高表達組控制率和進展率分別為62%和38%(P=0.000)，有顯著性差異. Cox回歸分析顯示，在基于紫杉醇化療的晚期乳腺癌患者臨床進展相關因素中，βⅢtubulin的OR值為28.789，95% CI（3.212~28.072），P=0.004. 本組病例顯示，近期療效中βⅢtubulin低表達患者有效率為48.89%，而βⅢtubulin高表達有效率為25.0%，差異顯著(P=0.036). βⅢtubulin低表達患者進展率為6.45%，而βⅢtubulin高表達者為25.0%(P=0.037)，均有統計學意義. 與文獻［4-6］結果基本一致，即βⅢtubulin高表達NSCLC患者紫杉類化療后控制率低，進展率高，而βⅢtubulin低表達患者控制率高，進展率低. 表明βⅢtubulin表達與紫杉類化療耐藥相關. 在生存期方面，KaplanMeier 分析顯示：βⅢtubulin低表達NSCLC患者中位OS和PFS分別為15和11 mo，而βⅢtubulin高表達者分別為12和8 mo，經Logrank檢驗，有統計學意義(P＜0.05). 與文獻［1，5］結果一致，即βⅢtubulin高表達患者OS和PFS短，而βⅢtubulin低表達患者OS和PFS長，表明βⅢtubulin高表達是紫杉類化療后患者預后不良的一個指標. 綜上所述，Ⅳ期NSCLC標本βⅢtubulin高表達者對紫杉類藥物耐藥，βⅢtubulin低表達NSCLC患者對紫杉類藥物敏感. βⅢtubulin高表達NSCLC患者預后不良.

【參考文獻】 ［1］Seve P， Mackey J， Isaac S， et al. Class III betatubulin expression in tumor cells predicts response and outcome in patients with nonsmall cell lung cancer receiving paclitaxel［J］. Mol Cancer Ther， 2005， 4(12):2001-2007. ［2］Seve P， Isaac S， Tredan O， et al. Expression of class III {beta}tubulin is predictive of patient outcome in patients with nonsmall cell lung cancer receiving vinorelbinebased chemotherapy［J］. Clin Cancer Res， 2005， 11(15):5481-5486. ［3］Kelley MJ， Li S， Harpole DH. Genetic analysis of the betatubulin gene， TUBB， in nonsmallcell lung cancer［J］. J Natl Cancer Inst， 2001， 93(24):1886-1888. ［4］Mozzetti S， Ferlini C， Concolino P， et al. Class III betatubulin overexpression is a prominent mechanism of paclitaxel resistance in ovarian cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2005， 11(1):298-305. ［5］Rosell R， Scagliotti G， Danenberg KD， et al. Transcripts in pretreatment biopsies from a threearm randomized trial in metastatic nonsmallcell lung cancer［J］. Oncogene， 2003， 22(23):3548-3553. ［6］Paradiso A， Mangia A， Chiriatti A， et al. Biomarkers predictive for clinical efficacy of taxolbased chemotherapy in advanced breast cancer［J］. Ann Oncol， 2005， 16(Suppl 4): 14-19.