【關(guān)鍵詞】 血清藥理學(xué)

中藥復(fù)方血藥清藥理學(xué)是目前國(guó)內(nèi)外中藥藥理研究領(lǐng)域中的熱門話題之一，它起始于1987年，日本Iwama等［1］發(fā)表了用動(dòng)物含藥血清研究中藥的文章，并認(rèn)為用該方法研究中藥的在體作用是實(shí)用的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。其最大的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性以及體外實(shí)驗(yàn)的易操作性，避免了在中藥復(fù)方藥理研究的體外實(shí)驗(yàn)中，將中藥粗制劑直接加入體外反應(yīng)體系中，而造成不能真實(shí)地反映體內(nèi)藥物作用情況的發(fā)生，是體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)反應(yīng)相結(jié)合的一個(gè)較好的實(shí)現(xiàn)。但是作為一套科學(xué)規(guī)范的，可推廣的血清藥理學(xué)方法，還存在很多疑問(wèn)諸如給藥劑量、采血時(shí)間、血清滅活與否等問(wèn)題的爭(zhēng)論。近年來(lái)，血清藥理學(xué)不斷被應(yīng)用于中藥藥理研究中，甚至在西藥的藥理研究中也取得了較大的進(jìn)展。筆者綜合近年來(lái)國(guó)內(nèi)研究情況，簡(jiǎn)述如下。

1 血清藥理學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用就目前國(guó)內(nèi)學(xué)者研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，中藥血清藥理的研究主要在以下幾個(gè)方面。

1.1 中藥粗制劑的直接作用和藥物血清作用的比較 在中藥復(fù)方藥理研究的體外實(shí)驗(yàn)中，將中藥粗制劑直接加入到體外反應(yīng)系統(tǒng)中，在實(shí)驗(yàn)方法學(xué)上存在著許多問(wèn)題，中藥粗制劑的成分復(fù)雜，含有各種電解質(zhì)或雜質(zhì)成分，以及酸堿度的影響等，都會(huì)對(duì)其生理活性造成一定的影響，從而導(dǎo)致體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致。中藥復(fù)方一般是經(jīng)口服后，經(jīng)胃腸道吸收代謝失活或未經(jīng)吸收（如一些高分子化合物），以及藥物的非有效成分可能在胃腸道酶的作用下，轉(zhuǎn)化成有效成分，或通過(guò)體內(nèi)的其他系統(tǒng)間接產(chǎn)生作用。用含藥血清來(lái)做體外實(shí)驗(yàn)，不僅可避免中藥復(fù)方各種電解質(zhì)和雜質(zhì)的干擾，而且更接近體內(nèi)的藥物代謝，產(chǎn)生藥效的情況。徐瑤等［2］采用Greiss試劑檢測(cè)小柴胡湯醇提物及灌服小柴胡湯醇提物小鼠血清對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO的影響，研究小柴胡湯的抗肝損害的機(jī)制。結(jié)果顯示：小柴胡湯醇提物直接加入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中不影響NO的產(chǎn)生，而加入120 min、180 min、240 min采集的含小柴胡湯醇提物小鼠血清能促進(jìn)NO的產(chǎn)生，表明促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO的釋放可能是小柴胡湯的抗肝損害機(jī)制之一。這個(gè)研究結(jié)果提示，用含有藥物成分的血清代替中藥粗制劑進(jìn)行試驗(yàn)更接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥效的真實(shí)過(guò)程。

1.2 給藥劑量及含藥血清添加濃度的量效關(guān)系研究 血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法是以含藥血清作為藥源進(jìn)行觀察。體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，不同的血藥濃度產(chǎn)生不同的藥理作用，即量效關(guān)系。王力倩等［3］在觀察含苦參、仙鶴草的血清對(duì)肝癌腹水癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)中，提出了血清供體的給藥劑量參考公式為：給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)（按體表面積）×培養(yǎng)基內(nèi)稀釋度，結(jié)果表明，以參考公式計(jì)算的給藥劑量，可以達(dá)到一定的血藥濃度，具有抗腫瘤活性，而給予低于參考公式計(jì)算的劑量，則不能達(dá)到一定的血藥濃度，對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)無(wú)顯著作用。詹紅生等［4］用含藥血清方法觀察補(bǔ)腎益精方對(duì)破骨細(xì)胞功能的影響，分別以補(bǔ)腎益精方等效劑量的0.5、1.0、2.5倍劑量，連續(xù)兩次（間隔2 h）灌胃，于末次灌胃后1 h采血，各劑量組含藥血清添加濃度（體積比）又分別為10%、20%、30%。結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益精方含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的抑制作用呈明顯的劑量依賴關(guān)系，其中2.5倍劑量組的含藥血清抑制作用最強(qiáng)，同時(shí)結(jié)果也顯示每個(gè)劑量組有明顯的含藥血清濃度依賴關(guān)系，作用強(qiáng)度順序?yàn)?0%<20%<30%。說(shuō)明增加給藥劑量來(lái)提高藥效是有限的，提高含藥血清濃度更為合適。

1.3 采血時(shí)間的確定及時(shí)效關(guān)系的研究 時(shí)效關(guān)系的研究最近也成了國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究熱點(diǎn)，找出給藥后采血的最佳時(shí)間，可以避免藥效物質(zhì)被代謝減少或尚未吸收所造成的假陰性結(jié)果。目前中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的采血時(shí)間是60 min、90 min、120 min等，一般不超過(guò)360 min。詹紅生等［4］觀察不同時(shí)間采血對(duì)補(bǔ)腎益精方含藥血清抑制破骨細(xì)胞功能的影響，以等效劑量連續(xù)兩次（間隔2 h）灌胃，分別于末次灌胃后1 h、2 h、3 h采血，同等條件下制備生理鹽水灌胃對(duì)照血清，結(jié)果表明，1 h的含藥血清組的骨吸收陷窩數(shù)顯著低于其他各組。方素萍等［5］研究黃連解毒湯含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及黏附中性粒細(xì)胞能力的影響的實(shí)驗(yàn)中，觀察連續(xù)給藥3天后0.5、1、1.5、2、2.5 h所取黃連解毒湯（HLJDT）含藥血清對(duì)HUVEC增殖及黏附中性粒細(xì)胞（PMN）能力的影響，結(jié)果顯示各點(diǎn)的HLJDT含藥血清均有一定的抑制HUVEC PMN黏附的作用，且與取血時(shí)間點(diǎn)存在一定的時(shí)效關(guān)系，其抑制細(xì)胞黏附的最佳時(shí)間點(diǎn)為90 min左右。

1.4 給藥方式的研究 為了使藥物達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度，以便于藥理作用的研究，這就要求在制備含藥血清的過(guò)程中，必須有正確的給藥方式，目前主要有7～10天給藥法（每天給藥1次，連續(xù)給藥7～10天）；3次給藥法（連續(xù)灌胃3次，第1、2次間隔20 h，第2、3次間隔4 h）；2次給藥法（第1次給藥后2 h后，再以相同劑量重復(fù)給藥1次）。方素萍等［5］觀察給藥1次及連續(xù)給藥3天后所取黃連解毒湯（HLJDT）含藥血清對(duì)HUVEC增殖及黏附中性粒細(xì)胞（PMN）能力的影響，發(fā)現(xiàn)連續(xù)給藥3天組的含藥血清抑制HUVEC PMN黏附的作用更強(qiáng)。劉成海等［6］在抗纖維化的中藥復(fù)方血清藥理學(xué)的研究中，發(fā)現(xiàn)一次給藥抗正化瘀方各劑量、各時(shí)相組的藥物血清對(duì)星狀細(xì)胞增殖、中劑量各時(shí)相組藥物血清對(duì)肝細(xì)胞均無(wú)明顯作用，二次給藥低中高劑量組1 h后的藥物血清對(duì)星狀細(xì)胞［3H］TDR摻入明顯抑制，低中劑量組促進(jìn)肝細(xì)胞［3H］TDR摻入。

1.5 含藥血清低溫保存及滅活與否的研究 在中藥復(fù)方的血清藥理學(xué)研究中，往往需要制備大量的含藥血清，這就涉及含藥血清的保存問(wèn)題，含藥血清低溫保存是否影響其藥效，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵所在。周明眉等［7］以含頭風(fēng)飲（TFY）血清抗血小板釋放5-HT和阻滯內(nèi)皮細(xì)胞鈣通道作用為指標(biāo)，探討含藥血清低溫保存對(duì)其藥效的影響。結(jié)果顯示：含藥血清經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間低溫保存后藥效顯著降低（P<0.01），提示含藥血清進(jìn)行低溫冰凍保存仍影響其藥效，進(jìn)行血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)以使用新鮮血清或保存時(shí)間較短的含藥血清為宜。目前采集藥物血清后，多經(jīng)56 ℃ 30 min滅活，但也有不經(jīng)滅活而直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的。劉成海等［6］在研究抗肝纖維化的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，將滅活的正常大鼠的含藥血清作用于星狀細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)TDR摻入量較低。由此可看出，血清滅活后細(xì)胞增殖減弱，這可能與血清中細(xì)胞生成因子減少有關(guān)，這有助于減少血清的非藥理性因素的干擾。但國(guó)內(nèi)另外一些學(xué)者認(rèn)為，血清中含有的由機(jī)體產(chǎn)生的內(nèi)源性有效成分以及中藥中所具有的免疫活性多糖等一些有效成分會(huì)由于藥物血清的滅活而造成減少或喪失，從而必然影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其次血清滅活后的情況與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床用藥也不相符，不能反映用藥的真實(shí)過(guò)程。徐海波等［8］在探討中藥血清學(xué)方法一文中，提出了解決的方法，對(duì)于血清的非藥理性干擾，可采用設(shè)空白對(duì)照組的方法來(lái)加以排除，而對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)中的微生物感染可用微孔濾除菌來(lái)防止。賀玉琢等［9］在研究灌服桂枝湯大鼠血清滅活前后對(duì)HSV-1致CPE的作用的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)正常動(dòng)物血清對(duì)照，以觀察正常動(dòng)物血清本身的作用，從而排除血清中存在的非藥理性的因素。李儀奎［10］在探討中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的若干問(wèn)題也提出了血清在什么情況下需要預(yù)處理的問(wèn)題，認(rèn)為當(dāng)空白血清出現(xiàn)顯著陽(yáng)性反應(yīng)，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，需要進(jìn)行血清的預(yù)處理。但由于血清預(yù)處理后所帶來(lái)的諸如以上提到的一些問(wèn)題，故實(shí)驗(yàn)中究竟是否需要預(yù)處理，應(yīng)視具體情況而定，不能一概論之。

1.6 血清藥理學(xué)在分析有效化學(xué)物質(zhì)方面的應(yīng)用 采用血清藥理學(xué)的方法篩選藥物，對(duì)含藥血清進(jìn)行化學(xué)分離，從血清中尋找有效成分，或通過(guò)含藥血清作用與中藥粗制劑直接作用的比較，分析其有效成分，有利于搞清中藥在體內(nèi)的有效活性物質(zhì)，并且有利于從傳統(tǒng)醫(yī)藥中篩選和開(kāi)發(fā)新的藥物。黃偉毅等［11］觀察益氣通絡(luò)丹對(duì)小鼠平滑肌細(xì)胞（VSMC）的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益氣通絡(luò)丹含藥血清中可能含有直接或間接可抑制VSMC增殖的活性物質(zhì)，該物質(zhì)是益氣通絡(luò)丹經(jīng)過(guò)復(fù)雜的體內(nèi)代謝過(guò)程產(chǎn)生的。吳清和等［12］采用血清藥理學(xué)方法研究了三黃乙肝膠囊對(duì)HBeAg的體外抑制作用。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）發(fā)現(xiàn)含三黃乙肝囊的家兔血清對(duì)HBeAg具有明顯的抑制作用，并隨著血清中藥物濃度的升高、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，而三黃乙肝膠囊粗制劑對(duì)HBeAg的直接抑制作用更強(qiáng)于含藥血清，提示三黃乙肝膠囊中的有效成分可能未從胃腸道完全消化吸收或部分有效成分在體內(nèi)代謝失活。Iwama等［1］應(yīng)用血清藥理學(xué)方法研究中藥復(fù)方小柴胡湯的致有絲分裂作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小柴胡湯煎劑濃縮液直接加到細(xì)胞培養(yǎng)基中有致有絲分裂作用，而用含小柴胡湯血清則無(wú)此作用，并分析原因認(rèn)為小柴胡湯致有絲分裂作用，可能由一些不能從胃腸道吸收的大分子物質(zhì)產(chǎn)生，或因其有效成分經(jīng)消化道或肝臟代謝失活所致。

2 中藥復(fù)方研究中對(duì)血清藥理學(xué)的評(píng)價(jià)血清藥理學(xué)的方法是中藥復(fù)方研究中體外實(shí)驗(yàn)的一個(gè)新思路。開(kāi)拓了中藥藥理研究的新領(lǐng)域。綜合近幾年來(lái)血清藥理學(xué)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)中藥血清藥理學(xué)有如下幾點(diǎn)評(píng)價(jià)：（1）含藥血清與傳統(tǒng)的中藥粗提物直接加入法比較，更接近中藥復(fù)方在體內(nèi)的代謝過(guò)程，可以較好地反映中藥的藥效作用機(jī)制，能夠在一定程度上揭示中藥及其復(fù)方在胃腸內(nèi)處置過(guò)程。（2）含藥血清能更確切地評(píng)價(jià)和篩選有效藥物或藥物有效成分，是一種比較接近現(xiàn)實(shí)的中藥藥效評(píng)價(jià)和篩選系統(tǒng)。（3）血清藥理學(xué)使現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)有了一個(gè)切實(shí)可行的結(jié)合點(diǎn)，可以應(yīng)用細(xì)胞和分子生物學(xué)手段來(lái)闡述藥理機(jī)制，便于觀察和追蹤藥物的吸收和代謝過(guò)程，有利于中藥真正有效成分、有效活性部位的發(fā)現(xiàn)，為新藥開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。（4）血清藥理學(xué)的廣泛應(yīng)用推動(dòng)了血清藥化學(xué)、中藥分析化學(xué)、中藥及其復(fù)方藥物動(dòng)力學(xué)等新的中藥藥理學(xué)分支學(xué)科的發(fā)展，并且血清藥理學(xué)與其相關(guān)學(xué)科的緊密結(jié)合，將有利于中藥的研究深入到細(xì)胞和分子水平，促進(jìn)了中藥現(xiàn)代化。但是作為方法而言，同樣存在著許多問(wèn)題及局限性，國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)于這方面的研究文獻(xiàn)到目前為止累計(jì)有近百篇，歸納起來(lái)大概有以下幾點(diǎn)：（1）血清提供者的種屬問(wèn)題，應(yīng)盡可能采用與細(xì)胞同一種屬的動(dòng)物來(lái)制備含藥血清，由于不同種屬的腸道菌落群不同，有效成分的代謝等差異可能造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同；（2）由于藥物和觀察指標(biāo)的不同，必須在實(shí)驗(yàn)中首先進(jìn)行量效和時(shí)效的研究，確定給藥劑量、采血時(shí)間、血液添加濃度等制備含藥血清的實(shí)驗(yàn)條件，若實(shí)驗(yàn)條件不同，會(huì)直接應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；（3）含藥血清的保存和滅活與否的問(wèn)題，由于具體情況不同，有的實(shí)驗(yàn)需要對(duì)血清滅活，以排除非藥理性的干擾因素，但在其他的一些實(shí)驗(yàn)中，血清的滅活以及低溫保存都有可能導(dǎo)致血清中有效成分的喪失，從而影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（4）不是所有中藥都通過(guò)血液起作用，也有不通過(guò)血液而起作用的，中藥對(duì)消化道的直接作用，以及中藥本身的四氣五味所起的作用，難以在血液中實(shí)現(xiàn)，這方面血清藥理學(xué)是無(wú)能為力的；（5）由于中藥藥理學(xué)機(jī)制的多樣性，任何一種單一元素在復(fù)方藥效作用中是微效的，但這種微效作用可累積成較強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)，且由于各組分之間的相互作用，大多數(shù)組分是有效成分還是無(wú)效成分尚不能確定，就目前的技術(shù)手段，不具備分析復(fù)方血清中所有單一成分的能力，這限制了中藥血清藥理學(xué)在中藥復(fù)方研究和新藥開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用范圍。國(guó)內(nèi)學(xué)者［13］認(rèn)為，中藥血清藥理學(xué)尚處于探索階段，許多方面仍需進(jìn)一步的完善。中藥血清藥理學(xué)目前存在的許多問(wèn)題，需要不斷地加強(qiáng)研討，以及依賴于相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。但其本身所具有的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)使之處于不可取代的位置。筆者相信，隨著今后的大量的系統(tǒng)的研究，以及其他一些相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和支持，在方法學(xué)上不斷規(guī)范和完善，建立一個(gè)中藥血清藥理學(xué)研究的方法體系。這必將有助于促進(jìn)中藥現(xiàn)代化的研究，有助于促進(jìn)中藥走向世界。