作者：韓林 賈波 石含秀 沈濤 由鳳鳴

【關鍵詞】 中藥 血清藥理學 研究方法

中藥血清藥理學是指將中藥或中藥復方經口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清，用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種實驗技術。1988年日本學者田真代一[1]提出了血清藥理學的概念和實驗方法。國內20世紀90年代初開始探索，近10年來此法越來越多地應用于中藥藥理的研究。

1 中藥血清藥理學研究方法現狀

1．1 動物模型制備

1.1.1 實驗動物選擇 不同種屬的動物，血清成分不同，人與動物血清更存在差異。陸慧晶[2]認為，選擇動物時應盡量選與人類生物特性近似的物種，制備血清的動物應與獲取離體器官、組織細胞的動物相一致，從而縮小或避免動物血清之間以及動物血清和人類血清之間在理化、生物等特性上的差異，提高實驗結果的可靠性。劉成海等 [3]提出，在體外培養(yǎng)實驗中宜采用同一種單一血清，既為細胞提供營養(yǎng)，又為藥物載體，還避免了多種血清的干擾。動物常采用大鼠小鼠、兔、豚鼠等來制備血清。一般家兔和大鼠應為首選。

1.1.2 離體組織(細胞)選擇 體外培養(yǎng)細胞的供體動物與含藥血清的供體動物應同種屬。因為實驗是要在體外盡可能準確的再現在體實驗時藥物與機體相互作用的整個過程，所以應盡可能減少因動物種屬差異而造成的免疫反應。因此，在體外培養(yǎng)實驗中宜采用同種單一血清，既為細胞提供營養(yǎng)，又為藥物載體，還避免了多種血清的干擾[4] 。

1.2 動物給藥方案

1.2.1 給藥途徑 一般多用口服(灌胃) 給藥方式制備含藥血清，由于中藥新型制劑不斷產生，也可以用注射、皮膚、粘膜、呼吸等給藥途徑來試驗制備含藥血清。一般在制備含藥血清時，供體動物的給藥途徑應該與臨床給藥途徑一致，以避免由于給藥途徑的不同帶來結果的差異[5]。

1.2.2 給藥劑量 血清藥理學很重要的一個問題是給藥劑量的確定，合適的給藥劑量，對保證實驗的成功很重要。給藥劑量目前尚無統(tǒng)一標準。因含藥血清加入反應體系后，濃度被稀釋，使反應體系的濃度達不到在體條件下的藥物濃度。王力倩等6]發(fā)現，以參考公式:給藥劑量= 臨床常用量×動物等效面積系數×培養(yǎng)基內血清稀釋度，計算給藥劑量，得到的含藥血清對腫瘤細胞體外生長有抑制作用，而比上述參考公式計算的給藥量小1 倍量的含藥血清無明顯作用。在這種情況下，如果反應體系出現陰性反應，并不能排除藥物濃度過低而出現的假陰性反應。李儀奎等 [7]提出兩種方法:一是增大給藥劑量，即給藥劑量= 在體實驗的給藥劑量×反應體系中被稀釋倍數(同上述王力倩所提參考公式) 。然而，其不足之處是給藥劑量與血藥濃度并不是呈等比增加，況且受到灌胃藥物濃度和體積的限制。二是按新藥藥理研究的技術要求設計劑量給藥，將含藥血清制成冷凍干燥粉，以凍干粉形式加入反應體系使其達到所需濃度。其優(yōu)點是:根據需要提高體外反應體系中的含藥濃度或形成等容，有利于血清的儲藏保存。王寧生等 [8]認為，給藥劑量以整體模型動物的有效劑量8～18 倍為宜。筆者認為，實驗給藥劑量，最好通過預實驗解決。

1.2.3 給藥次數與時間間隔 目前常用的方法有:1 次給藥或間隔2～4 小時給藥，或1天1～3 次，連續(xù)3～10 天。根據藥代動力學理論，以固定給藥時間間隔，相同劑量多次重復給藥后血藥濃度達到穩(wěn)態(tài)，并將在穩(wěn)態(tài)下不同采血時間取得的含藥血清進行實驗，均表現較高而且相似的藥理作用強度。孟李[9]就復方丹參血清對中性粒細胞釋放活性氧的影響，探討含藥血清制備方法的實驗，證實了此觀點。說明同一給藥方案連續(xù)數日給藥較1 次給藥有明顯差異，與藥物誘導機體產生內源性生物活性物質有關[10] 。此結論目前已成共識。目前國內很多學者提出每天給藥3 次，連續(xù)5～7 天的給藥法，認為與臨床用藥情況相合同時蓄積的血藥濃度已近坪值。

1.3 采血時間 理想的采血時間應該在血藥濃度的高峰期。蒙一純[11]認為，根據實驗動物消化生理特點和中藥吸收轉化特點確定取血時間范圍是合理的。如大鼠一般1～2小時 可達血藥濃度峰值，此時血清即為含藥血清;時間延長將有部分藥物組分發(fā)生轉化，成為藥物代謝血清。一般采血時間多集中在末次給藥后30min～3小時間。由于中藥復方給藥后，不同藥物達峰時間不同，故對于采血時間很難有一個統(tǒng)一標準。筆者認為應對不同時間分別采血進行預實驗，將不同時間的含藥血清進行比較后再確定采血時間，是較為可靠和科學的方法。

1.4 含藥血清的預處理和保存

1.4.1 含藥血清的預處理 血清中有許多酶、抗體、補體及其他生物活性物質，它們對體外培養(yǎng)的組織細胞及離體組織器官可能有作用，甚至嚴重影響實驗結果。 因此，在許多情況下有必要對血清進行預處理。通常有3 種方法。①丙酮法: 向血清內加入4～5 倍量丙酮，混勻，于3000 r/ min 離心，取上清液溫水浴上蒸發(fā)，除去丙酮; ②乙醇法: 向血清內加入4～5倍95%乙醇，混勻，于3000 r/ min 離心，取上清液溫水浴上蒸發(fā)，除去乙醇; ③加溫法: 56 ℃水浴上放置30min。這3 種方法主要去除了血清中的大部分蛋白質、糖及部分電解質，血清的正常生理活性基本喪失，容易突出血清中中藥的作用。同時，從實驗中可看到，滅活血清不易起泡沫，對實驗干擾較小。趙萬紅等[12]認為，在對含藥血清進行滅活時還要考慮兩點: ①這3 種處理方法并不能去掉血清的所有正常活性; ②有可能去掉或減弱血清中中藥的作用。這些情況沒有統(tǒng)一的解決辦法。

1.4.2 含藥血清的保存 周明眉等 [13]以含頭風飲血清抗血小板釋放52HT 和阻滯內皮細胞鈣通道作用為指標，探討了低溫保存和血清滅活對含藥血清的影響。研究發(fā)現含藥血清經長期低溫保存(-20℃，2個月) 后藥效顯著降低(P<0.01) ，提示含藥血清在保存過程中其中藥有效成分會發(fā)生分解等變化，致使藥效成分含量顯著降低，即使低溫冷凍保存仍影響其藥效。故進行血清藥理學試驗時宜使用新鮮滅活或保存時間較短的含藥血清。

1.5 含藥血清加入量和對照組的設立 從實驗設計的角度考慮血清藥理學實驗方法時，應控制好實驗結果的真實性和可比性，基本原則是:一是研究含藥血清的加入量來評價血清中藥物的真實有效濃度;二是設立正常血清空白對照組來排除血清本身所含干擾性物質對實驗結果的影響。張瑋函等[14]研究了當歸補血湯及其含藥血清對小鼠紅系造血祖細胞克隆的影響。結果顯示，等劑量的2 組當歸、黃芪，其含藥血清與正常血清比分別為1∶5 和1∶1 ，歸芪1∶5 組促進CFU2E 和BFU2E 的增殖的作用要明顯強于1∶1 組(P<0.01) 。嚴永杰等[15]探討了反應體系中含藥血清的加入量對實驗結果的影響。實驗顯示，當頭風飲含藥血清與富含血小板血漿(PRP) 的比值為1∶4 時血清抗血小板釋放52HT 作用最強.一般認為，以10 %的血清添加量為宜[16];血清中含有許多活性物質，它們當中大多會對藥效結果產生一定的影響，為排除實驗當中的此類干擾因素，實驗過程中必需設立嚴格的空白血清對照組。

2 存在問題與研究的難點

中藥血清藥理學起步較晚，現仍處于探索階段，尚不可完全替代傳統(tǒng)中藥藥理實驗方法。①血清本身內源性成分復雜，給中藥血清藥理學研究帶來了極大困難；② 不同種屬、不同年齡的動物對藥物吸收有一定差異，從而影響到血清中含藥成分及其含量。因此，開展中藥血清藥理學研究有待于規(guī)范動物的種屬和年齡；③ 因給藥劑量、采血時間不同，血清中含藥成分及其含量也不盡相同，故必須充分把握好給藥劑量及采血時間；④不同個體，會出現含藥血清差異，增加了研究難度。

3 中藥血清藥理學研究方法的幾點設想

3.1 含藥血清和中藥粗制品協(xié)同研究 大多數試驗表明，含藥血清療效較好，中藥粗體物無效，也有相反的結論，還有兩者均有作用。這表明中藥血清和粗提物的作用是有區(qū)別的，有的是中藥原藥起作用，有的經胃腸道消化吸收后起作用。如能協(xié)同研究，可以更好的發(fā)現中藥發(fā)揮作用的物質基礎，對于臨床用藥也更有指導意義。

3.2 離體試驗和在體試驗并行 離體實驗條件易控制，可以排除體內干擾，但由于體內外的環(huán)境不同，體內外的細胞功能不完全相同。如果離體實驗與在體實驗相配合，能從深層次上闡明復方制劑的作用機制，并且能更好的與臨床實驗相符，從而增加實驗設計的說服力。

3.3 血清藥理學、血清藥化學、藥物動力學同步 迄今含藥血清試驗方法偏重于藥效研究，沒有對血清中有效成分作更深層次的分析，尚缺乏對血清中所含藥物成分的定性、定量分析，其在體內的代謝過程也未知。若能以空白血清做對照，借助光譜圖、色譜圖等分析技術，對藥物血清做綜合技術評定，同時監(jiān)測多種成分的血藥濃度變化及其藥效變化，建立藥效—藥動—時間三維模型，研究其相關性，血清藥理學、血清藥化學、藥物動力學同步進行，系統(tǒng)研究，尋求和探索科學方法，勢必加速中藥研究的發(fā)展。

3.4 血清藥理學的研究與中醫(yī)辨證施治結合 辨證施治是中醫(yī)診治疾病的方法和特點，實驗醫(yī)學卻往往忽視中醫(yī)的內涵，多采取辨病論治的方式。由于辨證可以反映疾病內在規(guī)律，疾病又是辨證施治的依據，所以，中藥血清藥理學的研究應與中醫(yī)辨證施治結合起來，既體現中醫(yī)特色，又符合臨床需要。

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