作者：羅春麗， 張永萍， 邱德文， 鄭維發

【關鍵詞】 民族

摘要：目的實驗旨在應用中藥血清藥理學研究方法，研究民族藥余甘子對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響，對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響以及對小鼠腹腔巨噬細胞細胞活化作用的研究。方法余甘子采用鮮果榨汁經冷凍干燥凍干保存。小鼠隨機分6組，其中時效關系研究2組，量效關系研究4組。按0.2 ml/10 g體重用余甘子溶液灌胃。灌胃后30～180 min內不同時相無菌取血，利用中藥血清藥理學方法對實驗血清作時效關系研究及量效關系研究。結果與結論時效關系研究表明，用余甘子凍干粉溶液灌胃后30～180 min內不同時相含藥血清對小鼠脾淋巴細胞具有活化作用，并在給藥2 h時實驗血清活化作用明顯；量效關系研究表明，余甘子大劑量組實驗血清對促進小鼠脾淋巴細胞增殖，促進小鼠腹腔巨噬細胞細胞活化作用以及小劑量組實驗血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響均具顯著差異性。

關鍵詞：余甘子； 含藥血清； 腹腔巨噬細胞； 淋巴細胞； S180腹水腫瘤細胞； 免疫調節

Study on the Immunoregulatory Effect of Phyuanthus Emblica in Mice

Abstract:ObjectiveThe experiment applies the traditional Chinese medicine Plasma Pharmacology. This experiment studies how Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica， the traditional Chinese medicine，promotes the propagate of the spleen lymphocyte of small mice， how it influents the survival rate of the mouse S180 ascites tumor cell and how it activates the macrophage in the abdominal cavity.MethodsAdopt the fresh fruit juice of Phyuanthus emblica. Dry it and keep in freeze. The small mice are randomly pided in 6 groups. Among them， 2 groups are studied in time-efficacy relation， the other 4 are studied in quantity-efficacy relation. Infuse the solution of Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica 0.2 ml per 10g weight into the stomach of the small mouse. Take the blood in sterile environments at different time after 30min but before 180min， then study the time-efficacy relation and the quantity-efficacy relation with the traditional Chinese medicine Plasma Pharmacology.Results and ConclusionThe study of time-efficacy relation expresses that after infusing the solution of Phyuanthus emblica Phyllanthus emblica， medicated serum in different time activates the spleen lymphocyte of small mice differently after the 30min but before 180min. During this period， on 2h the activation of the medicated serum is the most obvious. The quantity-efficacy relation research expresses that megadose promotes the propagate of the spleen lymphocyte of small mouse and activates the macrophage in the abdominal cavity more obviously. On the other hand， the small dosage influents the survival rate of the mouse S180 ascites tumor cell more obviously.

Key words:Phyuanthus emblica; Drugcontaining sera; Immunoregulation; S180 ascites tumor cell; Spleen lymphocyte

余甘子為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實，余甘子首載于《南方草木狀》（為晉朝嵇含所著，是世界上最早的一部地方植物志）。余甘子在本草中首載于唐?蘇恭《新修本草》。作為民族藥最早被記載的是西藏帝瑪爾?丹增彭措著的《晶珠本草》。實驗研究證實，余甘子具有抗氧化、抗致畸、防腫瘤、抗病原微生物、降壓、抗愛滋病毒、降血糖及改善糖尿病并發癥、補益及降脂減肥等作用。證明其在提高機體免疫力方面具有很好的調節作用。中藥血清藥理實驗方法具有體外實驗條件可控性強，藥物效應易于檢測，可深入揭示藥物作用機理等優點，又能防止中藥粗制劑本身理化性質對實驗的干擾，還可反映出藥物中可吸收部分的直接作用。體現了體外和體內實驗較好的結合。實驗采用較先進的血清藥理學方法，用小鼠服藥后的含藥血清代替中藥煎劑進行體外實驗，對脾臟淋巴細胞增殖活性、對小鼠腹腔巨噬細胞細胞活化作用以及對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響進行免疫功能檢測，通過時-效關系及量效關系對余甘子的藥理作用及免疫調節作用機理作進一步闡明。

1 材料

1.1 試劑RPMI1640培養基（日本株式制藥會社出品）；10%新生小牛血清（美國Sigma公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、刀豆蛋白-Ⅳ型（ConA-Ⅳ）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 藥品余甘子為鮮果榨汁的冷凍干燥粉。

1.3 實驗動物昆明種健康小鼠，雌雄各半，體重（26±2）g，由江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室動物房提供。

1.4 實驗儀器超凈工作臺；SHELATC2323型CO2孵育箱；日本產BIO-RED 550型酶標儀；96孔培養板；24孔培養板；數控恒溫水浴箱；血球記數板（上海醫用光學儀器廠 XB-K-25）。

2 方法

2.1 余甘子灌胃后不同時相含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖的促進作用 2.1.1 含藥血清的制備參照文獻［1］，小鼠用余甘子大劑量組（40.0 g鮮果/kg）灌胃，為成人日劑量的20倍。按0.2 ml/10 g體量灌胃給藥，于給藥后30，60，90，120，180 min分別用乙醚吸入麻醉，摘眼球無菌取血，37℃促凝，3 000 r/min離心10 min分離血清，血清呈透明、清亮、淡黃色、無沉淀、未溶血。56℃，30 min滅活（除去血清中的補體）。4℃保存備用（3 d之內有效）。

2.1.2 正常小鼠對照血清的制備小鼠用蒸餾水0.2 ml/10 g體重灌胃，30 min后摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min離心10 min分離血清，4℃保存備用（3 d之內有效）。

2.1.3 脾淋巴細胞懸液制備參照文獻［2］，正常小鼠脫頸椎處死，體積分數為0.75的酒精浸泡消毒，無菌取出脾臟，置盛有5～10 ml Hanks液平皿的100目銅網上，輕輕捻碎，使單個細胞經網進入Hanks液中，并移吸至刻度離心管中800 r/min離心10min，經Tris-NH4Cl除去紅細胞，Hanks液洗3遍，鏡下細胞記數，用RPMI1640培養液配成5×106/ml懸液。

2.1.4 余甘子不同時相含藥血清促進淋巴細胞增殖測定參照文獻［3］，于96孔培養板中每孔加入100 μｌ脾淋巴細胞懸液，再加入100 μｌ，2 5 μg/ml ConA溶液及20 μｌ的實驗血清，4復孔；20 μｌ空白血清，4復孔，37℃、體積分數為0.05的CO2培養48～72 ｈ。培養結束前4～6 ｈ每孔加入MTT溶液10 μl，培養結束棄去上清，每孔加入DMSO溶液200 μｌ，充分震蕩后靜置20 min，酶標儀測定A490 nm值。

2.2 余甘子含藥血清促進小鼠脾淋巴細胞增殖

2.2.1 含藥血清的制備參照文獻［4］，小鼠隨機分4組，每組6只，生理鹽水組、余甘子大劑量組（40.0 g鮮果/kg）、余甘子中劑量組（20.0 g鮮果/kg）、余甘子小劑量組（10.0 g鮮果/kg）。按0.2 ml/10 g體重量灌胃給藥，1次/d，連續給藥7 d。于末次給藥120 min后，摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min離心10 min分離血清，血清呈透明、清亮、淡黃色、無沉淀、未溶血。56℃，30 min滅活（除去血清中的補體）。4℃保存備用（3 d之內有效）。

2.2.2 正常小鼠對照血清的制備小鼠用蒸餾水0.2 ml/10 g體質量灌胃，30 min后摘眼球取血，37℃促凝，3 000 r/min離心10 min分離血清，4℃保存備用（3 d之內有效）。

2.2.3 脾淋巴細胞懸液制備正常小鼠脫頸椎處死，75%酒精浸泡消毒，無菌取出脾臟，置盛有5～10 ml Hanks液平皿的100目銅網上，輕輕捻碎，使單個細胞經網進入Hanks液中，并移吸至刻度離心管中800 r/min離心10 min，經Tris-NH4Cl除去紅細胞， Hanks液洗3遍，鏡下細胞記數，用RPMI1640培養液配成5×106/ml懸液。

2.2.4 余甘子含藥血清促進小鼠脾淋巴細胞增殖測定于96孔培養板中每孔加入100 μｌ脾淋巴細胞懸液，再加入100 μｌ，2 5 μg/ml ConA溶液及20 μｌ的實驗血清，4復孔；20 μｌ空白血清，4復孔，37℃、體積分數為0.05的CO2培養48～72 ｈ。培養結束前4～6 ｈ每孔加入MTT溶液10 μｌ，培養結束棄去上清，每孔加入DMSO溶液200 μｌ，充分震蕩后靜置20 min，酶標儀測定A490 nm值。

2.3 余甘子含藥血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響

2.3.1 含藥血清的制備同上2.2.1。

2.3.2 正常小鼠對照血清的制備同上2.2.2。

2.3.3 S180腹水腫瘤細胞懸液的制備無菌條件下取S180腹水癌細胞，用基本1640液洗滌離心3次后，用完全1640液配成3×105個/ml備用。

2.3.4 S180腹水腫瘤細胞存活率的測定于96孔培養板中每孔加入100 μl S180腹水癌細胞懸液，再加入100 μｌ，25 μg/ml ConA溶液及20 μl的試驗血清，4復孔；20 μl空白血清，4復孔，37℃、體積分數為0.05的CO2培養48～72ｈ。培養結束前4～6ｈ每孔加入MTT溶液10 μｌ，培養結束棄去上清，每孔加入DMSO溶液200μｌ，充分震蕩后靜置20 min，酶標儀測定A490nm值。

2.4 余甘子含藥血清對小鼠腹腔巨噬細胞的活化作用

2.4.1 含藥血清的制備同上2.2.1。

2.4.2 正常小鼠對照血清的制備同上2.2.2。

2.4.3 小鼠腹腔巨噬細胞分離

2.4.4 巨噬細胞活性測定將巨噬細胞分裝于96孔培養板中，每孔100 μl，分別加入含藥血清20 μl，4復孔，空白血清20 μl，4復孔，輕輕震蕩，37℃、體積分數為0.05的CO2孵育2 h，每孔加入MTT溶液10 μl，輕輕震蕩，37℃、體積分數為0.05的CO2繼續孵育2 h，取出，小心吸去上清液，每孔加入DMSO溶液200 μl，輕輕震蕩，酶標儀測定A490 nm值。

3 結果

3.1 余甘子灌胃后不同時相含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性的促進作用。與正常對照組比較，余甘子溶液40.0 g鮮果/kg體重灌胃，其(60～120)min等不同時相的含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性均具有促進作用（P＜0.01），而30 min，(150～180)min的含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性無明顯促進作用（P＞0.05）。結果見表1。

表1 不同時相余甘子含藥血清對小鼠淋巴細胞增殖活性（略）

3.2 余甘子含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性與正常對照組比較，余甘子溶液大、中、小3個劑量組灌胃，分別于末次給藥120 min后摘眼球取血，含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性均具有促進作用。其中大、中劑量組含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖活性具明顯促進作用（P＜0.01），小劑量組對小鼠脾淋巴細胞增殖活性促進作用不顯著（P＞0.05）。結果見表2。

表2 余甘子含藥血清對小鼠淋巴細胞增殖活性（略）

3.3 余甘子含藥血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響與正常對照組比較，余甘子溶液大、中、小3個劑量組灌胃，分別于末次給藥120 min后摘眼球取血，含藥血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率均具有抑制作用。其中小、中、大劑量組含藥血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率具明顯抑制作用（P＜0.01）。結果見表3。

表3 余甘子含藥血清對小鼠S180腹水腫瘤細胞的影響(略)

3.4 余甘子含藥血清對小鼠腹腔巨噬細胞的活化作用與正常對照組比較，余甘子溶液大、中、小3個劑量組均具有一定促進作用。其中大劑量組具明顯促進作用（P＜0.01），中、小劑量組對小鼠腹腔巨噬細胞細胞增殖活性促進作用不顯著（P＞0.05）。結果見表4。

表4 余甘子含藥血清對小鼠腹腔巨噬細胞的活化作用(略)

4 討論

本實驗旨在應用中藥血清藥理學研究方法，研究民族藥余甘子鮮果汁冷凍干燥粉促進小鼠脾淋巴細胞增殖，對小鼠S180腹水腫瘤細胞存活率的影響以及對小鼠腹腔巨噬細胞活化作用。在采用血清藥理學方法進行實驗前，進行余甘子時效關系研究是必要的，以便找出給藥后的最佳采血時間，這樣可以避免由于藥物被代謝或尚未吸收造成的假陰性結果，理想的采血時間應在血藥濃度的高峰期。由實驗結果可以看出，余甘子對免疫功能的藥效影響集中在服藥后60～120，180 min后藥效逐漸消失，這對臨床用藥可能有一定的指導意義。因此，首先通過考察時-效關系以確定余甘子含藥血清的最佳采血時間，在此基礎上進一步對余甘子免疫調節作用做量-效關系研究。采用中藥血清藥理學研究方法，中藥粗制劑經口服吸收后，用含有藥物成分的血清代替中藥粗制劑進行體外實驗則可排除中藥粗制劑直接加入離體反應體系中各種影響因素的干擾，更接近藥物在體內環境中產生藥理效應的真實過程，使實驗結果的可信度大大提高。另外，若能將血清藥理學與血清藥物化學有機的結合起來，將有助于中藥藥代動力學的研究和中藥藥效物質基礎的闡明。余甘子為民族傳統習用藥材，貴州又為八大產區之一，野生資源豐富。余甘子藥物制劑及保健品的開發，必將促進余甘子藥材資源開發，也將推動貴州地方經濟的發展。

［1］ 梁春敏，王賢喜，董 群，等. 玉屏風散對小鼠免疫調節作用的血清藥理學研究［J］. 上海免疫學雜志，2003，23(6):385. ［2］ 董子明，張義國. 樹突狀細胞的特性和功能［J］.河南醫學研究，1999，8（1）:77. ［3］ 許化溪，劉龔植. 小鼠脾臟樹突狀細胞的分離與鑒定［J］.上海免疫學雜志，1991，11（3）:129. ［4］ 王勇，王亞平，祝彼得. 人參總皂苷對小鼠造血細胞增殖的影響［J］.解剖學雜志，1995，18:153. ［5］ 王力倩，余上才，李儀奎.用中藥血清藥理學的方法觀察苦參、仙鶴草的抗腫瘤作用［J］.中國中醫藥科技1995，2(5) :19. ［6］ 伍雪芳，梁春敏.玉屏風散對小鼠腹腔巨噬細胞活化作用的血清藥理學研究［J］.基層中藥雜志，2001，15