作者：于海榮， 王濟興， 張風英， 陳建雙， 宋鴻儒

【關鍵詞】 穿山龍總皂苷；，，T淋巴細胞增殖;，，白細胞介素

摘要：目的用血清藥理學方法研究穿山龍總皂苷對大鼠脾淋巴細胞增殖及其分泌IL2的影響，探討其可能的作用機理。方法用MTT法測定不同濃度穿山龍含藥血清（分別在培養系中加入20%，10%，5%含藥血清）對Con A誘導脾淋巴細胞增殖的影響；用雙抗體夾心ELISA法測定不同濃度穿山龍總苷含藥血清對Con A誘導脾淋巴細胞分泌IL2影響。結果20%和10%穿山龍總皂苷含藥血清可抑制Con A誘導的脾淋巴細胞增殖（P<0.01， P<0.05），20%和10%穿山龍總皂苷含藥血清可抑制Con A誘導的脾淋巴細胞分泌IL2（P<0.01，P<0.05）。結論穿山龍總皂苷含藥血清可抑制Con A誘導的大鼠脾淋巴細胞增殖及IL2的產生。

關鍵詞：穿山龍總皂苷； T淋巴細胞增殖; 白細胞介素2； 血清藥理學

The Pharmacological Study of Whole Saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae Effect on Rats' T Lymph Cell Function

Abstract：ObjectiveTo study the effect of whole saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae on rats`spleen lymph cell's proliferation and its excreting IL2.MethodsBy MTT means， the way that the serum of different concentrations of whole saponin of RDN affect Con A's stimulating spleen lymph cell`s proliferation were measured. By double-antibodies-ELLISA means， the ways that serum of different concentration of RDN act on Con A's stimulating spleen lymph cell's excreting IL2 were measured as well.ResultsThe serum of 20% and 10% whole saponin of RDN lowered Con A's stimulating spleen lymph cell's proliferation (P＜0.01，P＜0.05). The serum of 20% and that of 10% of whole saponin of RDN could lower Con A's stimulating spleen lymph cell's excreting IL2 (P＜0.01，P＜0.05).ConclusionThe serum of whole saponin of RDN can lower Con A's stimulating the proliferation and excretion of IL2 of rats'spleen lymph cell.

Key words：Whole saponin of Rhizoma Dioscoeae Nipponicae； Tlymph cell proliferation； Interleukin2； Serum pharmacology 穿山龍又名穿地龍，野山藥，為薯蕷科多年生藤本植物穿山龍薯蕷根莖。民間多用其浸酒或煎服，治療風濕性關節炎、類風濕關節炎、過敏性皮炎等均有顯著療效。由于上述幾種疾病發病機制與免疫功能紊亂有關，考慮其可能具有以免疫抑制為主的免疫調節作用。穿山龍總皂苷為其提取物，本實驗研究也證實有良好的抗炎及免疫抑制作用，為進一步探討其免疫抑制作用機理，本研究采用血清藥理學方法，給大鼠灌服穿山龍總皂苷，采集其含藥血清，加入到體外培養系中，觀察穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導的脾淋巴細胞增殖及其分泌IL2的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑穿山龍總皂苷，由承德市寬城皂素廠提供，實驗時用含0.01%吐溫-80的生理鹽水研成混懸液使用；潑尼松，新鄉市太利藥業有限公司，批號010806為純品原料藥，實驗時用含0.01%吐溫-80的生理鹽水研成混懸液使用。青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A均為 Sigma公司產品。L-谷氨酰胺、RPMI1640為GIBCO公司產品。大鼠IL2試劑盒：美國BIOSOURCE公司產品。四甲基偶氮唑藍（MTT）瑞士FIUKA公司產品。二甲基亞砜（DMSO），Na2HPO412H2O，KH2PO4，NaCl，KCl，MgSO4H2O， MgCl2，CaCl2等均為國產分析純。

1.2 動物健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，體重160~180 g，由承德醫學院動物室提供。

2 方法

2.1 含藥血清的制備取Wistar大鼠30只，隨機分成三組：穿山龍總皂苷實驗組，潑尼松陽性藥物對照組和溶媒對照組，分別灌胃給以穿山龍總苷1 000 mg（kg?d）、潑尼松9 mg （kg?d）和含0.01%吐溫80的生理鹽水2 ml，1次/d，連續7 d，末次給藥后1 h，眶后取血，離心后取血清 ，將每組10只大鼠血清混合，經56℃水浴滅活30 min， 0.22 μm微孔濾膜除菌制得穿山龍含藥血清，潑尼松含藥血清、溶媒血清備用。

2.2 脾淋巴細胞懸液制備另取Wistar大鼠6只，無菌取脾，將6只大鼠脾細胞混合，雙蒸水破壞紅細胞，制備脾淋巴細胞懸液。

2.3 穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導的正常大鼠脾細胞增殖的影響（MTT法）穿山龍總皂苷含藥血清設3個劑量組，分別為20%，10%，5%含藥血清組，即在培養板每孔中加入穿山龍總皂苷含藥血清分別為20%，10%，5%，每個濃度組分別設相應濃度的溶媒血清組和潑尼松含藥血清對照。每組設6個復孔，每孔中加入3×106個/ml細胞懸液150 μl ，100 μg/ml的ConA 10 μl（終濃度為5 μg/ml），20%，10%，5%血清組各加入相應大鼠含藥或溶媒血清40，20，10 μl；每孔終體積不足200 μl的用RPMI1640補足。將培養板置5%的CO2培養箱飽和濕度37℃培養72 h。于培養結束前4 h，加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，置37℃5%CO2培養箱中繼續培養4 h。取出培養板，每孔加入200 μl二甲基亞砜（DMSO），靜置20 min，使紫色結晶呈完全溶解。取上清液150 μl于96孔培養板中，以無細胞懸液孔調零，570 nm處用酶標儀測OD值。

2.4 穿山龍總皂苷含藥血清對Con A誘導脾淋巴細胞分泌IL2的影響用24孔培養板，每孔加入3×106個/ml脾細胞懸液750 μl，100 μg/ml的ConA溶液50 μl（終濃度為5 μg/ml），20%，10%，5%血清組各加入相應含藥血清或溶媒血清200，100，50 μl，不足1 ml的用RPMI1640補足，將培養板置37℃，5%CO2培養箱中，培養48 h后，離心，沉淀，取上清液，測定各孔IL2含量。

2.5 統計學處理同一濃度的3種不同血清作用的比較、同種血清的3個不同濃度作用的比較均用F檢驗，若P<0.05，進一步做兩兩q檢驗。

3 結果

3.1 穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導正常大鼠脾細胞增殖的影響①20%，10%穿山龍總皂苷含藥血清組可抑制ConA誘導的正常大鼠脾細胞增殖，5%穿山龍總皂苷含藥血清組對ConA誘導的正常大鼠脾細胞增殖無顯著抑制作用。②各劑量穿山龍總皂苷含藥血清組與相應濃度的潑尼松含藥血清相比較作用無顯著差異（P>0.05）。③不同濃度的穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導的正常大鼠脾細胞增殖的抑制作用有劑量依賴性，各濃度組OD值關系為20%<10%<5% （P<0.05）。實驗結果見表1。

表1 穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導正常大鼠脾細胞增殖的影響（略）

*與*相比較P<0.01，**與**相比較P<0.05，***與***相比較P>0.05

3.2 穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導正常大鼠脾細胞產生IL2的影響①20%，10%穿山龍總皂苷含藥血清組對ConA誘導正常大鼠脾細胞IL2有抑制作用。5%穿山龍總皂苷含藥血清組對ConA誘導正常脾細胞產生IL2無抑制作用。②各劑量穿山龍總皂苷含藥血清組與相應濃度的潑尼松含藥血清相比較作用無顯著差異P>0.05。③不同濃度的穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導正常大鼠脾細胞產生IL2的抑制作用有劑量依賴性，各濃度組IL2含量為20%<10%<5% （P<0.05）。結果見表2。

4 討論

血清藥理學方法是指動物經口服給藥后采集含藥血清進行體外實驗的一種方法。現已成為中藥體外藥效學研究的一種重要方法。它是在以前體外實驗的基礎上加以改進形成的，以中藥血清代替中藥粗提物進行體外實驗，避免了中藥直接體外用藥的一系列干擾，不但能反映中藥及其代謝產物的藥理作用，而且能反映可能由藥物誘導機體內源性成分所產生的作用，更接近藥物在體內環境產生的真實過程。為從細胞分子水平研究中藥藥理學作用提供了新的手段。有關研究表明穿山龍總皂苷制劑皮下注射給藥可抑制小鼠免疫功能［1］。口服穿山龍總皂甙可抑制小鼠綿羊紅細胞溶血素抗體的生成，抑制小鼠二硝基氟苯所致遲發型超敏反應，說明其對體液免疫和細胞免疫均有抑制作用［2］。宋鴻儒等［3］發現其水煎劑體外給藥可抑制ConA誘導的小鼠脾細胞增殖。研究結果表明，穿山龍總皂苷含藥血清可抑制大鼠T淋巴細胞增殖，且其作用有劑量依賴性；穿山龍總皂苷可通過抑制T淋巴細胞增殖抑制大鼠細胞免疫功能。與其水煎劑直接加入體外培養系的結果一致。考慮可能有藥物中的成分通過腸道直接吸收產生一定的免疫抑制作用。

表2 穿山龍總皂苷含藥血清對ConA誘導正常大鼠脾細胞產生IL2的影響（略）

*與 *相比P<0.01，**與**相比P<0.05，***與***相比P>0.05

IL2，主要由活化的Th1細胞產生，在T細胞的活化、增殖、分化，Ｂ細胞分化、增殖和抗體生成及增強NK細胞活性的過程中均起到非常重要的作用。活化T細胞產生IL2能力的強弱可作為評價機體免疫功能的一項重要指標。IL2是T淋巴細胞增殖的關鍵免疫促進因子。本研究結果表明，穿山龍總皂苷含藥血清可抑制由ConA誘導的大鼠脾細胞生成IL2的能力，對IL2產生的抑制可能是其抑制T淋巴細胞增殖、抑制大鼠細胞免疫功能的途徑之一。中藥免疫制劑以其作用耙點多、藥理作用廣泛、毒副作用小等特點備受重視。但我國目前有關中藥免疫調節劑的研究主要集中在免疫增強方面，中藥免疫抑制劑的研究相對較為薄弱，已經上市的僅有雷公藤制劑等少數幾種。穿山龍總皂苷的免疫抑制及其毒副作用還需進一步研究，若能開發出以穿山龍總苷為原料的高效、低毒的免疫抑制中藥制劑將有深遠的意義。

［1］ 南景一.穿山龍水煎劑對小鼠免疫功能的抑制作用［J］.中草藥，1988，19（3）：22.

［2］ 高 巍，宋鴻儒，趙鐵華，等.穿山龍總皂苷對小鼠免疫功能的影響［J］.承德醫學院學報，2001，18（1）：9.

［3］ 宋鴻儒.穿山龍總皂苷體外給藥對T淋巴細胞增殖的抑制作用［J］.承德醫學院學報，1998，15（3）：178.