【摘要】 ：【目的】采用血清藥理學(xué)方法探討補腎健脾方體外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。【方法】補腎健脾方低、中、高劑量（分別為30.2、60.4、120.8g·kg-1)灌胃正常大鼠制備血清，將含藥血清直接添加于體外培養(yǎng)的2.2.15細胞中，培養(yǎng)10d，觀察含藥血清對2.2.15細胞HBV表面抗原（HBsAg）、HBV e抗原（HBeAg）分泌的影響。 【結(jié)果】補腎健脾方經(jīng)體內(nèi)代謝后能抑制2.2.15細胞HBsAg、HBeAg的分泌，并呈一定的量效與時效關(guān)系。低劑量組服藥后3h 1：4稀釋度含藥血清的HBeAg抑制率最高，為97.91%；而中劑量組服藥后3h 1：2稀釋度的含藥血清則達到抑制HBsAg的飽和量，其抑制率為86.84%。【結(jié)論】補腎健脾方具有一定的體外抗HBV作用。

【關(guān)鍵詞】 補腎健脾方/藥理學(xué) 肝炎病毒 乙型/藥物作用 細胞培養(yǎng) 血清藥理學(xué)

乙型肝炎病毒（HBV）感染至今仍無較理想、穩(wěn)定的治療藥物，拉米夫定等核酸抑制劑雖被認(rèn)為是目前治療HBV感染最有希望的藥物［1］，但停藥后易復(fù)發(fā)，并可引起HBV突變，產(chǎn)生耐藥性，因而需要尋找更好的抗病毒藥物。目前抗HBV藥物的體外篩選主要通過藥物直接作用于2.2.15細胞，觀察其毒性及對HBV表面抗原（HBsAg）、HBVe抗原（HBeAg）分泌的影響來判斷［2-3］。但藥物直接作用有效并不等于口服吸收經(jīng)體內(nèi)代謝后仍有效，因此，本實驗采用血清藥理學(xué)方法來探討中藥復(fù)方的體外抗HBV作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物

補腎健脾方(藥材均取自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科)組成：豬苓20g，茯苓20g，白術(shù)15g，澤瀉20g，黃芪30g，桑寄生30g，仙靈脾12g，葛根30g，苦味葉下珠30g，白花蛇舌草30g，白背葉根30g，山楂15g，丹參20g。按原方的劑量(總藥量為302g)常規(guī)煎煮，并濃縮成3.02g/mL的濃度。

1.2 試劑

DMEM(GIBCO)培養(yǎng)基（華美生物工程公司），另加入新霉素 (G418，由GIBCO提供)0.38g/L， HEPES(緩沖液)2.38g/L；四甲基偶氮唑鹽 (MTT，由SIGMA公司提供)以DMEM培養(yǎng)基作溶劑配成0.4g/L；二甲基亞砜(廣州新港化工廠)； HBeAg檢測試劑盒、HBsAg檢測試劑盒（ELISA法，由華美生物工程公司提供）。

1.3 細胞株

2.2.15細胞引自廣州空軍醫(yī)院。

1.4 實驗動物

SD大鼠20只，體質(zhì)量約為250g ，雌雄各半。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.5 主要儀器

二氧化碳孵箱(NAPCO 5410)；酶標(biāo)儀(BIORAD:3550)；TILD臺式冷凍離心機。

1.6 實驗方法

1.6.1 細胞培養(yǎng) 將長滿2.2.15細胞的培養(yǎng)瓶用0.6g/L的胰蛋白酶消化2～3min，棄消化液，加少量100g/L DMEM培養(yǎng)液輕輕吹打，將細胞配制成3×108/L單細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，其中留2孔作空白對照，其他每孔加細胞懸液0.1mL，空白孔每孔加100g/L DMEM 0.1mL， 37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)48h，貼壁后用于實驗。

1.6.2 藥物血清的制備［4-6］ 20只SD大鼠 隨機分成4組，分別為中藥低、中、高劑量組和正常血清組。正常血清組用2只大鼠，中藥低、中、高劑量組各用6只大鼠，分別按30.2、60.4、120.8g·kg-1劑量灌胃（相當(dāng)于50kg成人所用劑量的5、10、20倍），每日分2次灌胃，連續(xù)3d，末次給藥后1、2、3h（每個劑量的每個時間段各用2只大鼠），于無菌條件下自腹主動脈采血；正常血清組大鼠灌以蒸餾水，并于最后同時采血；靜置后，低溫離心（10000r/min，5min）分離血清，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 含藥血清對細胞的毒性試驗和抑制試驗 將10種不同條件的20份血清（含正常血清2份）分別按1：0、1：1的比例與20g/L DMEM維持液混和，各取100 μL/孔加入1個已滴有2.2.15細胞的96孔細胞板中，即血清終濃度為1：2和1：4，每種血清每個稀釋度取2孔，并設(shè)細胞對照組(不加藥)4孔及空白對照組2孔。細胞對照組及空白對照組每孔均加入20g/L DMEM 100μL。

加入血清后培養(yǎng)10d，吸取培養(yǎng)液放入另一個96孔板中，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行HBsAg和HBeAg測定，用酶標(biāo)儀以450nm波長測定D值，求出含藥血清對抗原的抑制百分率［2］：p抑制/%=（D細胞對照組-D給藥組）/（D細胞對照組-D空白對照組）×100%。

藥物對抗原的抑制百分率：p抑制/%=（D正常血清組-D含藥血清組）/（D正常血清組-D空白對照組）×100%。

原96孔板中每孔加0.4g/LMTT0.1mL， 37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育4h，棄上清后加二甲基亞砜0.1mL溶解，然后以490nm波長比色測定D值，求出含藥血清對細胞的破壞百分率［4］：p抑制/%=（D細胞對照組-D給藥組）/（D細胞對照組-D空白對照組）×100%

1.7 統(tǒng)計方法 組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗（SPSS 8.0 for windows 統(tǒng)計軟件包）。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對2.2.15細胞的毒性作用

MTT的D值能間接反映細胞存活情況，D值越高，細胞存活數(shù)目越多，反之亦然。從表1可看出，各組血清對2.2.15細胞無毒性作用，反而能促進其生長，且與一定的血清濃度成正比，與藥物的有無關(guān)系不大，這可能與血清中含有豐富的營養(yǎng)成分等物質(zhì)能促進體外細胞生長有關(guān)。

2.2 含藥血清對2.2.15細胞HBsAg、HBeAg分泌的影響

2.2.1 正常血清組與細胞對照組比較

從表1可知，正常血清組HBsAg、HBeAg D值與細胞對照組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。但正常血清組的2個濃度之間均無顯著性差異（P＞0.05），表明正常大鼠血清中可能含有抑制兩抗原分泌的物質(zhì)，至于具體是什么物質(zhì)，將有待進一步研究。

2.2.2 中藥各劑量組與細胞對照組比較

表1結(jié)果顯示，中藥各劑量組的HBsAg、HBeAg D值與細胞對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），表明含藥血清能抑制兩抗原的分泌。

2.2.3 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2的含藥血清與同濃度正常血清組比較表1 含藥血清各劑量組的細胞毒性及對兩抗原的抑制作用

2.2.4 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2、1：4的含藥血清組比較

表1結(jié)果顯示，除中藥低劑量組兩濃度對HBeAg的抑制無顯著差異外，其他各劑量組均以1：2濃度對兩抗原的抑制作用較強。

2.2.5 中藥低、中、高劑量終濃度為1：2的含藥血清組比較

表1、表2結(jié)果顯示，中藥低、中、高劑量1：2含藥血清組間的HBeAg D值均無顯著性差異，其對HBeAg的抑制率分別為94.68%、95.01%、93.77%。HBsAg D值中藥中、高劑量組較低劑量組顯著性降低。

以上結(jié)果表明，中藥低劑量終濃度為1：4時已達到最大限度抑制HBeAg的飽和量，而要達到近乎最好的HBsAg抑制效應(yīng)則須中劑量終濃度為1：2的含藥血清，在這以前，抑制率隨劑量的增加而增高，達到最高抑制效應(yīng)（飽和量）以后，再加大藥量亦不能使其抑制率顯著增高。

2.2.6 中藥各劑量灌藥后1、2 、3h終濃度為1：4含藥血清對HBeAg抑制作用的比較

從表3可看出，對于HBeAg的抑制作用，中藥低劑量1h與2h無顯著性差異（P＞0.05），而2h與3h則有顯著性差異（P＜0.01），說明灌藥后3h的抑制作用最強。

2.2.7 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：2含藥血清對HBsAg抑制作用的比較

由表4可看出，對于HBsAg的抑制作用，中藥中劑量1h與2h、2h與3h均無顯著性差異（P＞0.05），而1h與3h則有顯著性差異（P＜0.05），以3h的抑制率最高。

以上含藥血清對兩抗原的抑制率均是藥物和血清共同作用所得的結(jié)果。但由于正常血清對兩抗原亦有一定的抑制作用，因此若要排除正常血清作用的干擾，單純考慮藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后對兩抗原的抑制率，如表5所示：藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后對2.2.15細胞HBeAg、HBsAg的最高抑制率分別為94.53%和65.75%。 3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對慢性乙型肝炎的病原體、流行病學(xué)、自然病程、發(fā)病機制、病理變化等方面均作了較深入的研究，但至今仍未能找到徹底治療HBV感染的藥物。目前國內(nèi)有關(guān)中醫(yī)藥治療慢性乙型肝炎的研究不少，在其病因病機的認(rèn)識方面也基本一致，主要是"濕熱余邪兼血瘀，肝郁脾腎氣血虛"。我院消化內(nèi)科羅日永教授在繼承已故肝病名醫(yī)鐘耀奎教授學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗，提出慢性乙型肝炎的治療關(guān)鍵在于補脾腎、清余邪，采用健脾補腎為主，佐以清熱利濕的治法，其自擬的補腎健脾方在臨床治療慢性乙肝患者取得了較好的療效［7］。

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［8］，苦味葉下珠、山楂有較強的抗HBV作用，澤瀉有明顯的退黃作用，丹參是目前公認(rèn)的抗纖維化的良好藥物，而黃表2 不同劑量含藥血清對HBsAg、HBeAg的抑制率表3 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：4含藥 ①：P＜0.01，與中藥低劑量2 h組比較(vs 2hour lowdose KSP group)芪、白術(shù)、茯苓、豬苓、白花蛇舌草、仙靈脾、葛根均有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，如黃芪、豬苓、茯苓能提高巨噬細胞系統(tǒng)吞噬能力及自然殺傷細胞（NK細胞）、淋巴因子激活殺傷細胞（LAK細胞）的活性，使CD3、CD4明顯增高、CD4/CD8比值升高，調(diào)節(jié)細胞因子，促進產(chǎn)生白細胞介素2（IL2）和IL2受體（IL2R），促進細胞免疫反應(yīng)及溶解免疫復(fù)合物、抗腫瘤作用；白術(shù)除能促進免疫功能外，還可增強腎上腺皮質(zhì)功能及護肝抗腫瘤作用；葛根還可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（TNF）的產(chǎn)生、抑制超敏反應(yīng)、增強機體抗感染力；白花蛇舌草還有抗腫瘤、抗炎作用 。

補腎健脾方各組成藥物的免疫調(diào)節(jié)作用基本得到初步的證實，但究竟有無直接抗病毒的作用則未見報道。目前評價藥物體外抗HBV作用常用的2.2.15細胞系是用含有2個頭尾相連HBVDNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細胞HepG2而成的［3］，表4 中藥各劑量組1、2、3h終濃度為1：2含藥表5 藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后對2.2.15細胞兩抗原的能持續(xù)高量地分泌HBsAg和HBeAg。而通過藥物對HBsAg、HBeAg分泌的影響，可作為評價藥物體外抗HBV作用的一個指標(biāo)［2］。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，雜質(zhì)也較多，如果把藥物直接作用于細胞，往往不能真實反映藥物的臨床有效作用。因此，本實驗嘗試采用血清藥理學(xué)的方法，希望能更真實地反映藥物通過體內(nèi)代謝后對細胞的毒性和對兩抗原的作用。本研究結(jié)果表明了補腎健脾方藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后能有效地抑制2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的分泌，而無明顯毒性，較藥物直接作用于無毒濃度下的抑制率高［9］，且能更真實地反映藥物的真正抗HBV作用，為體外抗HBV實驗在方法學(xué)上的改進提供了依據(jù)。從實驗結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，HBeAg對藥物敏感性較好，只需較低劑量即可被有效抑制，而HBsAg則需較高劑量才能被有效抑制。

同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)正常大鼠血清在促進2.2.15細胞生長的同時，能有效地抑制HBsAg和HBeAg的分泌，這到底是由于血清中干擾素等細胞因子的作用所致，還是其他原因所致，尚待進一步研究。

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