作者：曹燕明 徐海波 張薇 陳基長

【關(guān)鍵詞】 骨性關(guān)節(jié)炎/中藥療法;，骨炎定/藥物作用;，細(xì)胞培養(yǎng);，兔

摘要: 【目的】觀察補(bǔ)腎益氣活血方骨炎定對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。【方法】將新西蘭兔隨機(jī)分為空白組和骨炎定低、中、高劑量組（劑量分別為2.5、5、10g/kg）;以骨炎定高劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，于最后1次給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h分別取血，分離含藥血清，作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)不同時(shí)相的骨炎定含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用;并取給藥后2h含藥血清，部分滅活，比較滅活血清與不滅活血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，以及檢測(cè)不滅活含藥血清不同作用時(shí)間（12、24、36h）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響;以骨炎定低、中、高劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，取最后1次給藥后2h含藥血清，觀察不同劑量骨炎定對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。【結(jié)果】高劑量骨炎定給藥后0.5～4h制備的含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均有顯著促進(jìn)作用（均P<0.01），其中以給藥后2h者作用最強(qiáng);滅活與不滅活血清均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用（P<0.01），且后者作用強(qiáng)于前者（P<0.05）;不滅活含藥血清作用12、24、36h后均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用（P<0.01），且呈時(shí)效關(guān)系;低、中、高劑量骨炎定含藥血清均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)作用（P<0.01），并呈量效關(guān)系。【結(jié)論】補(bǔ)腎益氣活血方骨炎定對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞: 骨性關(guān)節(jié)炎/中藥療法; 骨炎定/藥物作用; 細(xì)胞培養(yǎng); 兔

在骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的病理機(jī)制中，骨組織血管萎縮、數(shù)量減少、血供不足是非常重要的一環(huán)，而血管在骨的形成和修復(fù)過程中所起的重要作用在于豐富的血管是保障骨組織再生時(shí)血供充分的必要條件 ［1］ 。補(bǔ)腎益氣活血方骨炎定（Guyan ding）是陳基長教授根據(jù)中醫(yī)理論，并結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，主治骨性關(guān)節(jié)炎。經(jīng)多年臨床研究證實(shí)，該方可改善OA患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙，改善骨內(nèi)壓和異常的血液循環(huán)，在臨床中取得顯著療效 ［2］ 。本文觀察了骨炎定含藥血清對(duì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 骨炎定由紅花、牛膝、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、黃芪組成，按常規(guī)方法煎煮，經(jīng)紗布過濾并濃縮成含生藥2kg/L的藥液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?1.2 動(dòng)物 新西蘭兔，雌雄各半，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為2000A018。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同時(shí)相的含藥血清促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 ［3-4］ 新西蘭兔4只，隨機(jī)分成空白組和骨炎定組，雌雄各半。骨炎定組以10g/kg劑量灌胃給藥，空白組以等容積的蒸餾水灌胃，每天2次，早晚各1次（每日藥物總量相當(dāng)于60kg成人臨床用量的20倍），連續(xù)7d。于最后1次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h兔耳中央動(dòng)脈采血，無菌分離血清，經(jīng)0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩①徸訡CTCC（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至第3～5代，以含體積分?jǐn)?shù)為15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)成5×10 7 個(gè)/L的細(xì)胞懸液，100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO 2 溫箱中飽濕靜置培養(yǎng)48h;更換無血清的DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞同步化12h，每孔加入100μL不同時(shí)相采集的空白兔血清或骨炎定含藥血清，每組均設(shè)8個(gè)平行孔，總體積為200μL/孔;置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO 2 溫箱中飽濕靜置培養(yǎng)36h，每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h以進(jìn)行顯色反應(yīng);以體積分?jǐn)?shù)為50%二甲基甲酰胺（DMF）―200g/L十二烷基硫酸鈉（SDS）0.1mL終止反應(yīng)，室溫靜置過夜;待孔內(nèi)藍(lán)色結(jié)晶完全溶解后置酶標(biāo)儀上測(cè)波長570nm處吸光度（D）。

1.3.2 血清滅活與否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 ［4-5］ 按1.3.1方法選取最后1次灌胃給藥后2h的兔進(jìn)行耳中央動(dòng)脈采血，無菌分離血清，一部分血清經(jīng)56℃、30min滅活處理;一部分不滅活，經(jīng)0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎?.3.1方法檢測(cè)滅活血清和不滅活血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。

1.3.3 不同劑量的含藥血清促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 ［3，5］新西蘭兔8只，隨機(jī)分成空白組和骨炎定低、中、高劑量組，雌雄各半。骨炎定低、中、高劑量組分別以2.5、5、10g/kg灌胃給藥，空白組灌胃等容積的蒸餾水，每天2次，早晚各1次（每日藥物總量分別相當(dāng)于60kg成人臨床用量的5倍、10倍、20倍），連續(xù)7d。于最后1次灌胃后2h兔耳中央動(dòng)脈采血，無菌分離血清，經(jīng)0.45μm、0.2μm雙層微孔濾膜過濾除菌，置-40℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩２捎?.3.1方法檢測(cè)不同劑量的含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。

1.3.4 不同作用時(shí)間的含藥血清促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的比較采用1.3.1方法檢測(cè)骨炎定含藥血清（10g/kg）作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞12、24、36h后的反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，數(shù)據(jù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，隨后進(jìn)行方差分析，最后采用Dunnett法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)相的含藥血清促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用 表1結(jié)果表明，給新西蘭兔每天灌胃2次，早晚各1次，連續(xù)7d，于最后1次給藥后2h制備的含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)，與空白組比較，差異具有非常顯著性意義（P<0.01），即給藥后2h血藥濃度達(dá)到高峰。經(jīng)每天在固定時(shí)間間隔給藥2次、連續(xù)7d的方法可使血藥濃度保持在較高水平內(nèi)波動(dòng)，藥后0.5h至4h制備的含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的促進(jìn) 作用（均P<0.01）。為了更準(zhǔn)確地研究含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，在以下的實(shí)驗(yàn)中均采用藥后2h采血的方法制備含藥血清。 2.2 血清滅活與否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響表2結(jié)果表明，滅活與未滅活空白兔血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響無顯著性差異（P>0.05）。滅活高劑量含藥血清與未滅活高劑量含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖都有顯著的促進(jìn)作用（P<0.01），且后者作用強(qiáng)于前者（P<0.05）。為了更準(zhǔn)確地研究含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，在以下的實(shí)驗(yàn)中均采用未滅活血清。

2.3 不同劑量的含藥血清促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用表3結(jié)果表明，骨炎定低、中、高劑量含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用（P<0.01），且呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 骨炎定含藥血清不同作用時(shí)間促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的比較表4結(jié)果表明，未滅活空白兔血清能維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生長（P<0.05），未滅活高劑量含藥血清在作用12、24、36h后對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均有顯著的促進(jìn)作用，且隨著作用時(shí)間的延長，其促進(jìn)作用增強(qiáng)（P<0.01），呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎屬于祖國醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，其病因病機(jī)主要為久傷勞挫，瘀血阻絡(luò)，肝腎虧損，筋骨虛弱，治療以補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，益氣行血為原則。有研究表明各種致病因子所造成的全身或局部組織器官的缺血、缺氧、血循環(huán)障礙、血液流變性及粘滯性異常而導(dǎo)致的各組織器官水腫、炎癥滲出、血栓形成、組織變性、結(jié)締組織增生等一系列病理變化，均可概括在血瘀證的病理實(shí)質(zhì)之中，而這些病變的中心環(huán)節(jié)在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化 ［6］ 。活血化瘀法可降低骨內(nèi)壓 ［7］ ，改善骨性關(guān)節(jié)炎的癥狀 ［8］ 。且既往的研究及觀察發(fā)現(xiàn)在胚胎時(shí)骨形成與血管生成密切相關(guān) ［9］ 。所謂骨生發(fā)中心即位于血管化的環(huán)境中，而成骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞在新骨形成過程中總伴有毗鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞存在。無論膜內(nèi)成骨、軟骨內(nèi)成骨或骨折愈合均與血管存在與否有著密切的關(guān)系。與此同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)老年試驗(yàn)對(duì)象或患者發(fā)生骨質(zhì)疏松時(shí)，總是成骨細(xì)胞與血管生成同時(shí)減少。芮鋼等 ［10］ 將血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的 表1 高劑量骨炎定含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的變化趨勢(shì)細(xì)胞相容性，血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞的功能，提高成骨細(xì)胞的增殖能力。血管內(nèi)皮細(xì)胞增生可加速骨組織的再血管化過程，從而為成骨細(xì)胞提供正常的營養(yǎng)、神經(jīng)和體液調(diào)控。骨炎定是復(fù)方制劑，有的成分對(duì)軟骨細(xì)胞有保護(hù)作用 ［11］ ，有的成分對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的骨壞死有修復(fù)作用，本研究結(jié)果顯示骨炎定可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，這是否與該方可修復(fù)被破壞的軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，緩解骨性關(guān)節(jié)炎中晚期癥狀的機(jī)理有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究還表明，每天在固定時(shí)間間隔給藥2次、連續(xù)7d的方法可使血藥濃度維持在較高水平內(nèi)波動(dòng)，藥后0.5h至4h制備的含藥血清均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有較強(qiáng)的促進(jìn)作用 ［4］ 。滅活與未滅活空白兔血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響無顯著 性差異。但未滅活高劑量含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用比滅活的高劑量含藥血清更強(qiáng)。是否藥物作用于機(jī)體后產(chǎn)生了能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的類血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子樣的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，而這種內(nèi)生性有效成分又不耐熱，其原因有待進(jìn)一步證實(shí)。

未滅活低、中、高劑量含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。未滅活高劑量含藥血清在作用12、24、36h后對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，且隨著作用時(shí)間的延長，其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用增強(qiáng)。但臨床上究竟采用多大的劑量、多長的療程療效最好，且不良反應(yīng)最少，也尚需進(jìn)一步觀察研究。

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