[關鍵詞]青蒿琥酯；多藥耐藥；K562/A02細胞；谷胱甘肽

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對一種化療藥物出現耐藥的同時，對其他結構不同、作用靶位不同的化療藥物亦產生抗藥性，是腫瘤化療失敗和復發的根源。目前尋找低毒、高效的耐藥逆轉劑已經成為腫瘤治療研究的方向。K562/A02 細胞是經阿霉素逐步誘導、具有MDR表型的穩定細胞系。我們在研究青蒿琥酯抗腫瘤的過程中發現，K562/A02細胞同K562細胞一樣均對青蒿琥酯敏感，并且青蒿琥酯的存在可逆轉K562/A02細胞對阿霉素的耐藥性，其不影響K562/A02細胞Pgp的表達而顯著降低K562/A02細胞內谷胱甘肽（GSH）的含量，現報道如下。

1 材料和方法

1．1 細胞系及細胞培養人紅白血病細胞株K562及K562/A02細胞由東南大學臨床醫學院中心實驗室提供。K562細胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640 培養液，K562/A02細胞接種于含2 μg?ml-1阿霉素、10%小牛血清的RPMI 1640 培養液，置于37 ℃、5%CO2 培養箱中，2～3 d傳代1 次。

1.2 主要藥物及試劑青蒿琥酯（廣西桂林制藥二廠，批號 010901），臨用前溶于5％的NaHCO3溶液中，然后用RPMI 1640培養液稀釋；四氮唑藍（MTT，Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；Pgp 單抗(PEUIC2美國Coulter 公司)；GSH測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 青蒿琥酯對K562及K562/A02細胞增殖的影響取對數生長期K562及K562/A02細胞，調細胞濃度為1.0×105 ml-1 。青蒿琥酯分別用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養液及含2 μg?ml-1阿霉素、10%小牛血清的RPMI 1640 培養液稀釋，作用終濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg?ml-1。將各濃度青蒿琥酯分別與0.1 ml培養細胞加入96 孔平底培養板中，每組樣本設5個復孔。37 ℃、5%CO2 飽和濕度下培養48 h。在終止培養前4 h每孔加入MTT 20 μl(5 mg?ml－1)，繼續培養4 h后離心10 min，棄上清液，加入DMSO 150 μl，放在平板振蕩器上振蕩溶解甲10 min；將培養板置ELSA酶標儀在570 nm波長處測每孔的光密度（OD）值并記錄。計算抑制率并利用何爾恩法［1］計算半數抑制濃度（IC50）。抑制率＝（1-實驗組OD／對照組OD）×100％。

1．4 青蒿琥酯對K562/A02細胞 Pgp 表達的影響無菌收集對數生長期的K562及K562/A02細胞，細胞濃度為2×106 ml-1。PBS 洗滌，PEUIC2 4 ℃避光反應30 min，PBS洗滌后重懸，流式細胞儀檢測細胞Pgp平均熒光強度（MFI），設不加PEUIC2組作為自身陰性對照。K562/A02細胞經100 μg?ml-1青蒿琥酯處理48 h后無菌收集，配成濃度為2×106 ml-1的細胞懸液。按上述方法測Pgp的MFI。

1．5 青蒿琥酯對K562/A02細胞內GSH含量的影響取對數生長期K562及K562/A02細胞，調細胞濃度為1.0×105 ml-1 ，分為K562 細胞無藥組、K562/A02細胞無藥組及K562/A02 細胞藥物（100 μg?ml-1青蒿琥酯）處理組。培養48 h后收集細胞，PBS 洗滌后調整細胞數為1×106 ml-1，取2 ml破碎細胞，離心后留取上清。實驗按試劑盒說明書操作，顯色反應后測定吸光度，于595 nm波長處測定蛋白，412 nm波長處測定GSH含量。實驗重復4次。計算各實驗組蛋白含量及細胞內GSH 含量。

1．6 統計學處理數據用x-±s表示，兩組間采用t檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2．1 青蒿琥酯對K562及K562/A02細胞增殖的影響青蒿琥酯對K562及K562/A02細胞抑制率見表１。在不含阿霉素情況下，青蒿琥酯對K562及K562/A02細胞的IC50分別為13.80 μg?ml-1和13.62 μg?ml-1（P＞0.05），但是在阿霉素存在情況下，青蒿琥酯對K562/A02細胞的IC50為2.64 μg?ml-1，差異非常顯著（P＜0.01），說明青蒿琥酯可以逆轉K562/A02細胞對阿霉素的耐藥，兩者具有協同性。表1 青蒿琥酯對K562及K562/A02細胞的抑制率

2．2 青蒿琥酯對K562/A02細胞Pgp 表達的影響在K562細胞的自身陰性對照組，Pgp的MFI為0.186±0.135，而在加入PEUIC2的K562細胞，Pgp的MFI為0.179±0.128 ，兩者之間差異無顯著性(P＞0.05)，說明K562細胞膜上沒有Pgp表達；加入PEUIC2的K562/A02細胞，Pgp的 MFI為23.006±3.431，與自身陰性對照組的0.387±0.229相比，差異有顯著性(P＜0.05)，說明K562/A02細胞膜上有Pgp高水平表達，提示Pgp參與了K562/A02的耐藥機制。K562/A02加入100 μg ?ml-1青蒿琥酯處理后的MFI為19.625±2.694，與藥物處理前的23.006±3.431相比，差異無明顯統計學意義(P＞0.05)，說明青蒿琥酯對Pgp表達無影響。

2．3 青蒿琥酯對K562/A02細胞內GSH含量的影響細胞內GSH含量K562/A02細胞為（143.210±25.344）mg?（mg pro）-1，K562細胞為（69.740±16.124）mg?（mg pro）-1，兩者相比，P＜0.05，差異具有顯著性，說明K562/A02細胞耐藥與GSH高表達有關。100 μg?ml-1青蒿琥酯處理48 h后，K562/A02細胞內GSH 含量為（65.040±10.674）mg?（mg pro）-1，較藥物處理前明顯降低(P＜0.05)。

3 討論

K562/A02 細胞是用逐步增加培養基中阿霉素濃度建立的一株有穩定的典型MDR表型的人白血病細胞系，具有Pgp表達陽性、mdr1 mRNA高表達、GSHs轉移酶(GST) 活性高、拓撲異構酶Ⅱ mRNA 低表達等生物學特性[2]。其中mdr1/Pgp表達異常增高可迅速將進入細胞內的藥物主動地“泵”出細胞外，降低白血病細胞內的藥物濃度，無法構成對白血病細胞的有效殺傷而導致MDR的發生；GST活性增高，增強了GSH與化療藥物或其氧化應激產物的結合，降低化療藥物細胞毒作用，同時促進藥物外排，也降低細胞內藥物濃度，因此細胞內GSH含量增高也是多藥耐藥的機制之一。青蒿素及其衍生物在全世界廣泛應用于抗瘧治療，對搶救和治療腦型和惡性瘧疾發揮著重要作用，尤其是對多藥耐藥的難治性瘧疾以其快速而顯著的療效和獨特機制而為世界所關注[3]。近年來，國內外許多學者[45]均報道青蒿素及其衍生物具有抗腫瘤的作用。本實驗中的青蒿琥酯無論是對K562細胞還是K562/A02細胞均顯示有良好的細胞毒作用，與阿霉素無交叉耐藥性，并且青蒿琥酯的存在可逆轉K562/A02細胞對阿霉素的耐藥性。本研究中Pgp表達水平測定結果顯示，K562細胞無Pgp表達，而K562/A02細胞顯示Pgp高表達，提示K562/A02細胞耐藥性與mdr1基因及其編碼的Pgp過表達有關。但在本研究中，當加用100 μg?ml-1青蒿琥酯后，K562/A02 細胞的Pgp表達水平均無明顯改變，提示青蒿琥酯逆轉K562/A02細胞的耐藥作用并不是通過直接下調Pgp表達水平而發揮作用。本研究結果顯示，耐藥的K562/A02 細胞內GSH含量高于敏感的K562細胞內GSH含量，提示細胞內GSH含量增高是K562/A02細胞形成MDR的機制之一。當加用100 μg?ml-1青蒿琥酯后，K562/A02細胞系的GSH含量明顯降低，說明青蒿琥酯逆轉K562/A02耐藥可能與此有關。研究表明[6]，青蒿素類藥物抗瘧機制為其利用瘧原蟲細胞內存在的鐵離子，催化裂解其分子結構中的過氧橋產生含碳自由基，該自由基烷基化細胞內蛋白，使其喪失功能，從而達到殺滅瘧原蟲的目的。據此推測青蒿琥酯逆轉耐藥的可能機制為其干擾了細胞內GSHGST系統功能的發揮，導致細胞內阿霉素濃度增加，恢復阿霉素的細胞毒作用。關于此點有待進一步研究證明。

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[6]DHINGRA V，VISHWESHWARRAO K，LAKSHMINARASU M. Current status of artemisinin and its derivatives as antimalarial drugs[J]. Life Sci，2000，66：279300.