作者：吳小鵬，陸曙炎，蔡雷銘，鄒建綱，周忠興，關乃富，陳仰之，陳靜

【關鍵詞】 膀胱腫瘤

Effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius on c-Fos expression in the brain of rats with asthma onset

Abstract:Objective To explore the effect of histamine H3 receptors in nucleus tractus solitarius（NTS）on c-Fos expres-sion in the brain of rats with asthma onset.Methods Male Sprague-Dawley（SD）rats were sensitized with ovalbumin to in-duce asthma using central stereotaxic and microinjection techniques.The model rats were randomly pided into three groups，injected NS，R-α-methylhistamine（RMHA，a H3 receptor receptors agonist），and thioperamide（Thio，a H3 receptors antago-nist）+RMHA into NTS respectively.Fos positive cells distributed in different nucleus were detected by immunohistochemistry SABC method after the challenge one hour later.Results After microinjection1μg RMHA into NTS at the onset of asthma，the number of Fos positive cell and Fos density presented in NTS，periventricular hypothalamic nucleus（Pe），hypothalamic paraventricular nucleus（Pa），and raraventricular thalamic nucleus（PVN）decreased markedly（P<0.01）.These effects can be blocked by pre-treatmentwith5μg microinjection of Thiop into NTS.Conclusion This study suggests that histamine H3 re-ceptors in NTS can ameliorate asthma via regulating some neurons in Pa，Pe and PVN. Key words:rats;nucleus tractus solitarius;histamine H3 receptors;asthma;Fos protein;expression ［摘要］目的: 檢測膀胱腫瘤細胞多藥耐藥情況，以選擇敏感藥物治療浸潤性膀胱腫瘤。 方法: 雙側髂內動脈灌注化療前采用免疫組織化學方法對10例膀胱腫瘤病例作多藥耐藥糖蛋白（P.gp）、谷胱甘肽S轉移酶（GST.p）和拓撲異構酶Ⅱ（TopoⅡ）表達情況檢測。 結果: 灌注前P.gp的表達率為30%，GST.p為10%，TopoⅡ為50%。灌注藥物選擇吡柔比星、順鉑和羥基喜樹堿。灌注后P.gp的表達率為50%，GST.p為10%，TopoⅡ為40%。 結論: 檢測P.gp、GST.p、TopoⅡ表達情況對浸潤性膀胱腫瘤化療藥物的選擇具有重要意義。 ［關鍵詞］ 膀胱腫瘤;多藥耐藥;免疫組織化學;化學治療 多藥耐藥（MDR）是導致腫瘤化療失敗的重要原因，多藥耐藥糖蛋白（P.gp）是引起MDR現象最常見的因素之一。2003年10月至2005年3月，作者對10例浸潤性膀胱腫瘤患者進行P.gp、谷胱甘肽S轉移酶（GST.p）和拓撲異構酶Ⅱ（TopoⅡ）表達情況的檢測，根據檢測結果選擇敏感藥物作髂內動脈灌注化療，觀察化療前后耐藥情況的變化，現報告如下。

1 資料與方法 1.1 一般資料 本組10例，男9例，女1例;年齡49～84歲，平均65歲。10例均經膀胱鏡活檢，病理檢查證實:移行細胞癌Ⅱ～Ⅲ級4例，浸潤至肌層，有盆腔淋巴結轉移，T3 期;Ⅲ級2例，浸潤至肌層，T2 期;Ⅰ級3例，T1 期。高分化鱗癌1例，浸潤至肌層，T1 期。

1.2 方法 采用Seldinger技術，局部麻醉下右側股動脈插入F4.5Cobra導管，分別進入髂總動脈、髂內動脈，選擇性插管進入雙側膀胱上、下動脈，造影顯示膀胱腫瘤的血供及血管分布情況，對腫瘤供血動脈聯合應用順鉑（DDP）、吡柔比星（THP）和羥基喜樹堿（HCPT）等化療藥物灌注。灌注藥物的劑量:DDP60～70mg、THP40～50mg、HCPT25mg。免疫組織化學方法采用DA-KO公司Envision系統，一抗均為原裝濃縮產品。P.gp抗體、GST.p抗體、TopoⅡ抗體均購自DAKO公司。

送檢標本10%中性福爾馬林固定;常規取材、乙醇脫水、石蠟包埋，常規切片、烤片入二甲苯脫蠟，經不同濃度的乙醇入水、入蒸餾水、入PBS緩沖液10min;組織切片視需要抗原修復20～30min后自然冷卻15min，加一抗抗體孵育30～40min，PBS緩沖液沖洗10min，滴加Envision檢測系統孵育30～40min，PBS緩沖液沖洗10min，滴加DAB顯色液10～15min，自來水沖洗10min，蘇木精染色液細胞核染色5～10min，組織細胞核分化1min，組織細胞核返藍10min，乙醇、二甲苯常規脫水、透明30min，中性樹膠蓋玻片封片。試劑由DAKO公司提供。 1.3 陽性判定的標準 P53、TopoⅡ的陽性顆粒定位于細胞核，染棕黃色;bcl.2、VEGF、P.gp、GST.p的陽性顆粒定位于細胞質或細胞膜。判定標準采用半定量方法，根據陽性細胞的數目，10%以下為±，10%～30%為+，31%～50%為++，50%以上為+++。

2 結 果 3例P.gp呈陽性（+～+++），2例GST.p呈陽性（++～+++），5例TopoⅡ為陽性（+～+++）。灌注藥物選擇:P.gp陰性、GST.p陰性者選擇THP加DDP;P.gp陽性、GST.p陰性、TopoⅡ陽性者選擇HCPT。

灌注化療后7～10d，9例手術切除腫瘤，標本再作免疫組織化學耐藥測定。1例P.gp由+++降為++，1例P.gp+者仍為+，1例P.gp++者仍為為++，1例P.gp由+變為++，1例P.gp陰性者變為++;1例GST.p由-變為+，1例GST.p仍為+++;4例To-poⅡ由+～+++變為+，1例TopoⅡ由+變為-。 2例灌注后1周行膀胱全切除術，分別隨訪6個月和3個月無復發;4例行膀胱部分切除術，隨訪6個月以上無復發;1例行經尿道膀胱腫瘤電切術，隨訪1年無復發;1例未手術，隨訪10個月復查CT，膀胱腫瘤范圍無明顯增大，無血尿，排尿通暢;2例行膀胱部分切除術者術后時間較短，尚無隨訪資料。

3 討 論 膀胱癌是常見的泌尿系統腫瘤，具有易復發和產生多藥耐藥的生物學特性。復發腫瘤期.級上升，容易產生耐藥性。腫瘤細胞的藥物耐受是影響化療效果的最重要因素。有統計顯示，90%以上腫瘤患者的死亡都不同程度地與藥物耐受有關。動脈灌注化療是治療浸潤性膀胱腫瘤的重要手段之一，但傳統灌注藥物的選擇帶有一定盲目性。檢測腫瘤細胞的耐藥譜可指導臨床用藥，因此，根據膀胱腫瘤MDR免疫組織化學檢測結果選擇敏感化療藥物進行動脈灌注化療具有重要的臨床指導意義。 本科開展髂內動脈灌注化療結合手術治療浸潤性膀胱腫瘤，患者1年生存率達91%［1］ 。動脈灌注化療能使多數浸潤性膀胱腫瘤明顯降期，使許多患者保留功能完整的膀胱，并能使部分高分期患者接受根治性膀胱全切除術，提高手術切除率［2］ 。 P.gp是由MDR基因mdr.1編碼的一個相對分子質量為17000的跨膜糖蛋白，具有依賴ATP的生物膜功能，可將多種化療藥物從胞內泵出胞外，從而導致耐藥。轉基因實驗已經證實，腫瘤細胞中由于P.gp過度表達，使細胞毒性藥物被泵出細胞外，細胞內藥物濃度下降，從而產生耐藥［3］ 。GST.p可與多種毒性藥物結合，起解毒作用。相當多的抗腫瘤藥物都是GSH.GST系統的作用底物，降低細胞內GSH濃度可以增加腫瘤細胞對許多藥物的敏感性［4］ 。DNA TopoⅡ可催化DNA超螺旋局部變構，使DNA松懈，影響細胞增殖和分化，在DNA復制、轉錄、有絲分裂染色體分離、DNA修復中均起關鍵作用，TopoⅡ是腫瘤化療的重要靶酶。MDR細胞株TopoⅡ含量降低而產生藥物耐受。許多抗癌藥物是以TopoⅡ為靶點的，其作用是使酶.DNA易解離復合物形成，最終引起細胞凋亡。高水平TopoⅡ表達是藥敏基礎，特別是TopoⅡα［5］ ，提示我們對于To-poⅡα高表達的腫瘤，可使用TopoⅡα抑制劑VP.16、阿霉素作為術后預防性灌注化療的首選藥物。P.gp在許多正常組織中缺乏，已經證實P.gp高表達的腫瘤細胞對阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌等藥物耐受，GST.p高表達的腫瘤細胞對阿霉素、DDP等藥物耐受，TopoⅡ低表達的腫瘤細胞對阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素耐受。

人體腫瘤組織內存在MDR基因。本組9例作了灌注化療前后腫瘤細胞耐藥檢測，并進行比較，發現化療藥物會升高P.gp的表達，降低TopoⅡ的表達，使腫瘤細胞對化療藥物敏感性降低，產生耐藥性。

作者治療浸潤性膀胱腫瘤的程序是:（1）作膀胱腫瘤活檢和腫瘤細胞耐藥檢測;（2）選擇敏感藥物作髂內動脈灌注化療;（3）手術切除腫瘤;（4）標本作腫瘤細胞耐藥檢測;（5）選擇敏感藥物定期作膀胱內灌注化療。本組10例均在灌注化療前作膀胱鏡活檢和腫瘤MDR免疫組織化學檢測，P.gp-、GST.p-者選擇THP加DDP;P.gp+、TopoⅡ+者選擇HCPT。作者的體會是:在臨床上制訂化療方案前，應先作腫瘤細胞MDR檢測，觀察有無耐受蛋白的表達，避免采用P.gp、GST.p和TopoⅡ耐藥譜中的藥物。既要考慮P.gp因素，又要考慮GST.p和TopoⅡ因素，對復發者及時修改化療方案，以便取得更好的療效。

隨著醫學分子生物學技術的發展，腫瘤細胞的耐藥檢測為膀胱腫瘤化療的敏感藥物選擇提供了更科學的依據。本研究病例有限，隨訪時間較短，尚待積累病例進行更進一步的研究。 ［

［2］李鳴，李寧忱，黃真，等.浸潤性膀胱癌術前選擇性髂內動脈灌注化療的近遠期療效觀察［J］.中華泌尿外科雜志，2004，（10）:662.664.

［3］DASCHNER P J，CIOLINO H P，PLOUZEK C A，et al.Increased AP.1activity in drug resistant human breast cancer MCF.7cells ［J］.Breast Cancer Res Treat，1999，53:229.240.

［4］ENOKIDA H，GOTANDAT，OKUS，et al，Reversal of P-glycop-rotein-mediated paclitaxel resistance by new synthetic isoprenoids in human bladder cancer cell line［J］.Jpn J Cancer Res，2002，93:1037.1046.

［5］陳傳忠，黃勤，陳仕平.DNA拓撲異構酶Ⅱ與多藥耐藥研究進展［J］.福建醫科大學學報，1998，32:215.217.