作者：陳牧 張建東 張育 王曉鈴 沈維干 李國(guó)青

【摘要】 目的探討三氧化二砷(arsenic trioxide， As2O3)對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞血管新生相關(guān)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)水平及基質(zhì)金屬蛋白酶2、9（MMP2、9）活性的影響。 方法用噻唑藍(lán)法(MTT)測(cè)定As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞上清中VEGF含量，用明膠酶譜法半定量測(cè)定細(xì)胞上清中MMP2、9的活性。 結(jié)果K562/A02細(xì)胞的IC50是（1.64±0.16）μM，0.05μM As2O3對(duì)細(xì)胞增殖和VEGF的表達(dá)沒有明顯影響，對(duì)MMP2、9的活性在24、48h無明顯影響(P>0.05)，但在72h則對(duì)MMP2、9的活性有明顯抑制作用(P<0.05)；0.4和3.2μM As2O3可顯著抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)VEGF并使MMP2、9活性減弱(P<0.05)。結(jié)論As2O3可能通過下調(diào)VEGF的表達(dá)和抑制MMP2、9活性而發(fā)揮抗白血病細(xì)胞血管新生作用。

【關(guān)鍵詞】 三氧化二砷； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 明膠酶譜

Effect of Arsenic Trioxide on Related Factors of Angiogenesis in K562/A02 Cells

Abstract：Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on the expression of VEGF and the activity of MMP2 and 9 in K562/A02 cells. MethodsMTT assay was used to detect the inhibition ratio of K562/A02 cell. Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the level of VEGF. Gelatin zymography assay was used to assess the activity of MMP2， 9. ResultsNeither the proliferation nor VEGF expression of K562/A02 cells was influenced by 0.05μM As2O3 after 24， 48 and 72 hours’ incubation. The activities of MMP2， 9 were not effected after 24， 48 hours’ incubation with 0.05μM As2O3 (P>0.05)， but they were significantly inhibited after 72 hours (P<0.05). 0.4 and 3.2μM As2O3 highly inhibited the proliferation， down regulated VEGF expression and inhibited the activity of MMP2， 9 of K562/A02 cells (P<0.05). ConclusionThe possible mechanism of antileukemic angiogenesis by As2O3 may be achieved by inhibiting the expression of VEGF and the activity of MMP2 and 9.

Key words：Arsenic trioxide;VEGF; MMP;Gelatin zymography assay

0引言

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(Multidrug resistance， MDR)是導(dǎo)致臨床白血病患者化療失敗的常見原因。 造成腫瘤細(xì)胞MDR的因素眾多， 其中血管新生(Angiogenesis)與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系正逐漸受到越來越多的重視。 腫瘤血管新生不僅是白血病發(fā)生、 發(fā)展和浸潤(rùn)的重要條件， 而且其相關(guān)因子， 如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase， MMP)所具有的復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)也直接或間接增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的MDR[1， 2]。 因此， 如果能有效下調(diào)多藥耐藥細(xì)胞表達(dá)的血管新生相關(guān)因子， 無論從腫瘤的血管新生還是多藥耐藥均具有積極意義。 本文即以白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞為研究對(duì)象， 通過對(duì)不同濃度三氧化二砷（Arsenic trioxide， As2O3）處理K562/A02細(xì)胞24、 48和72h后VEGF表達(dá)水平及MMP2、 9活性變化情況的研究， 進(jìn)一步闡明了As2O3對(duì)多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02的VEGF和MMP2、 9的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1藥物配制As2O3用1mM的NaOH溶液溶解并配成12.8mM貯備液，4℃貯存。實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基稀釋成0、0.05、0.4和3.2μM 4個(gè)濃度。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)K562/A02白血病耐藥細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液學(xué)研究所，接種于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清，100Ｕ/ｍl青霉素， 100μg/ｍl鏈霉素)，用濃度為2μg/ml的阿霉素以維持細(xì)胞耐藥性，于37℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)提前兩周停用阿霉素。

1.3MTT法測(cè)定As2O3對(duì)K562/A02增殖抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞， 以 1×105/ml的濃度接種于96孔板， 培養(yǎng)24h后離心去上清， 加入不同濃度As2O3含藥培養(yǎng)基， 孵育72h后用MTT法檢測(cè)570nm處吸光度， 并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。 抑制率=(1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.4ELISA測(cè)定細(xì)胞上清中VEGF含量細(xì)胞接種于24孔板， 培養(yǎng)方法同上， 經(jīng)不同濃度As2O3含藥培養(yǎng)基孵育24、48和72h后收獲細(xì)胞及上清。 VEGF檢測(cè)過程按試劑盒(博士德生物工程有限公司)說明書操作， 在450nm處測(cè)定OD值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MMP2、9活性用明膠酶譜法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整為2×105/ml，接種于24孔板，培養(yǎng)24h后離心去上清，加入不同濃度As2O3孵育24、48、72h后收獲上清。用Lowry’s法測(cè)定細(xì)胞上清蛋白濃度，并將上樣蛋白量調(diào)整為70μg/18μl，與1/6體積的上樣緩沖液混合孵育30min，上樣于含0.8%明膠的8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行垂直電泳，初始電壓80V，待溴酚藍(lán)至分離膠后加至150V。電泳結(jié)束后，將凝膠依次置于洗脫液中(25g/L TritonX100，50mM TrisHCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH 8.0)中振蕩洗脫45min×3次；漂洗液中(不含TritonX100的洗脫液)振蕩漂洗20min×3次，孵育液中(0.1M甘氨酸，50mM TrisHCl，5mM CaCl2，1μmol/L ZnCl2，0.5M NaCl，pH 8.0)37℃恒溫低速振蕩孵育48h。用考馬斯亮藍(lán)染液(0.1%考馬斯亮藍(lán)R250，甲醇300ml，冰醋酸100ml，蒸餾水450ml)染色1.5h，脫色液(30%甲醇，10%醋酸)脫色至陽(yáng)性條帶清晰且背景對(duì)比度適宜時(shí)取出凝膠，經(jīng)成像后即可對(duì)其進(jìn)行半定量分析。結(jié)果評(píng)價(jià)：電泳后負(fù)染帶亮度的強(qiáng)弱和面積大小可以半定量地表征明膠酶的活性大小。金屬蛋白酶活性評(píng)分方案在孫曉敏等[3]的評(píng)分法基礎(chǔ)上有所改進(jìn)，即：“0”分，條帶勉強(qiáng)可辨或未見任何條帶；“1”分，條帶邊緣及中央模糊，但可辨認(rèn)，寬度小于1mm；“2”分，條帶邊緣銳利且中央清晰，寬度小于1mm；“3”分，條帶邊緣模糊但中央清晰，寬度1～2mm；“4”分，條帶邊緣銳利且中央清晰，寬度1～2mm。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法IC50及ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)和one way ANOVA， P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用As2O3孵育K562/A02細(xì)胞72h后，MTT法測(cè)得IC50是(1.64±0.16)μM。0.05μM As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞的抑制率為－0.64%，可輕微促進(jìn)細(xì)胞增殖，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.4和3.2μM As2O3則對(duì)K562/A02細(xì)胞增殖的抑制率分別為25.1%和64.4%，表現(xiàn)為明顯的抑制作用(P<0.05)。

2.2As2O3對(duì)K562/A02表達(dá)VEGF的抑制作用ELISA法檢測(cè)VEGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸率為99.8%。結(jié)果顯示：0.05μM As2O3處理K562/A02細(xì)胞24、48和72h后，與對(duì)照組（0.00μm)相比，VEGF出現(xiàn)輕微上調(diào)，但該結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。0.4μM和3.2μM As2O3在作用24、48、72h后對(duì)VEGF均有明顯下調(diào)作用(P<0.05)。在相同時(shí)段，3.2μM As2O3相對(duì)其它濃度As2O3對(duì)VEGF的下調(diào)作用也更為顯著，見表1。

表1As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響（略）

注：*與對(duì)照組比較P<0.05

2.3As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞MMP2、9活性的抑制作用 MMP2、9凝膠結(jié)果見圖1，得分結(jié)果見表2。細(xì)胞上清經(jīng)電泳、復(fù)性等步驟后在凝膠上呈現(xiàn)出明亮的陽(yáng)性條帶，其寬度和亮度反映了MMP2、9的活性。凝膠結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的MMP2、9條帶在各時(shí)段均有表達(dá)。MMP2、9中以MMP2(72KD)的條帶最寬，MMP9次之，MMP2(62KD)最窄。從表2可以看出，MMP2、9在相同情況下受到As2O3抑制的基本趨勢(shì)是一樣的，均表現(xiàn)為隨As2O3濃度及作用時(shí)間延長(zhǎng)而抑制作用逐漸明顯。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示：①M(fèi)MP2、9經(jīng)0.05μM As2O3處理后在24、48h與對(duì)照組比較并無明顯差異(P>0.05)，72h差異才具有顯著性(P<0.05)，提示0.05μM As2O3在24、48h對(duì)MMP2、9沒有明顯抑制作用。②MMP2、9的活性經(jīng)0.4μM和3.2μM處理后隨As2O3濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而抑制作用也逐漸增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異均有顯著性(P<0.05)。

圖1As2O3對(duì)MMP2、9活性的影響（略）

表2MMP2、9的分值(平均值)比較（略）

注：*與對(duì)照組比較P<0.05

3討論

As2O3是中藥砒霜的主要成份，近年來發(fā)現(xiàn)它不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增生、促進(jìn)其凋亡等作用，還能有效下調(diào)腫瘤的血管新生。采用抗血管新生方案處理后的腫瘤細(xì)胞，其遷移能力以及耐藥性均有不同程度的降低。可見，抗腫瘤血管新生策略作為白血病的一種治療思路，與傳統(tǒng)的化療、放療等手段相結(jié)合應(yīng)用，對(duì)控制疾病的發(fā)展、提高緩解率、延長(zhǎng)患者的生存期均有積極意義。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 0.4和3.2μM As2O3對(duì)K562/A02細(xì)胞有明顯增殖抑制作用， 其IC50為（1.64±0.16）μM， 與相關(guān)報(bào)道一致[4]。 費(fèi)嘉等[5]用VEGF反義核酸研究發(fā)現(xiàn)， VEGF與腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。 在本課題中， 我們對(duì)As2O3處理K562/A02細(xì)胞后VEGF的變化情況也進(jìn)行了研究。 結(jié)果顯示， 0.4和3.2μM As2O3處理K562/A02細(xì)胞后， 隨時(shí)間延長(zhǎng)VEGF表達(dá)明顯下調(diào)； 對(duì)不同濃度As2O3處理相同時(shí)間后收獲的上清檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)， 隨As2O3濃度增加， VEGF的表達(dá)逐漸下調(diào)。 白血病細(xì)胞髓外浸潤(rùn)是造成腫瘤病人死亡的重要原因，該過程與蛋白水解酶降解胞外基質(zhì)密切相關(guān)。MMP2和MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的明膠酶，其主要生物學(xué)作用是水解胞外基質(zhì)和促進(jìn)新生血管的形成，它們對(duì)白血病髓外浸潤(rùn)有重要的病理學(xué)意義。我們研究已發(fā)現(xiàn)As2O3可以有效抑制K562/S細(xì)胞MMP2、MMP9 的活性，其作用的強(qiáng)度與劑量及作用時(shí)間有關(guān)[6]。為了進(jìn)一步探討As2O3對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株MMP2、9活性的影響，本課題選用明膠酶譜法對(duì)As2O3處理后的K562/A02細(xì)胞上清中MMP2、9的活性變化情況進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。結(jié)果顯示，MMP2、9在K562/A02細(xì)胞均有表達(dá)，這一結(jié)果與既往報(bào)道相似[7， 8]。從圖1中可以看到，條帶中以MMP2(72KD)最寬，MMP9次之，MMP2(62KD)則最窄。MMP2、9活性隨As2O3濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)而受到的抑制也逐漸增強(qiáng)。但0.05μM As2O3將細(xì)胞孵育24和48h后與對(duì)照組比較差異并不明顯，提示0.05μM As2O3對(duì)MMP2、9在短時(shí)間內(nèi)可能無明顯抑制作用。但72h后即可觀察到0.05μM As2O3對(duì)MMP2、9條帶有一定程度的抑制。目前文獻(xiàn)證實(shí)，VEGF水平與MMPs的表達(dá)存在調(diào)節(jié)關(guān)系[9]。MMPs與VEGF基因共同的上游調(diào)控因子，如NFκB、AP1和Ets等，可以促進(jìn)VEGF和MMPs表達(dá)[1012]。已有研究表明，VEGF可使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Ets量顯著增加[13]。另外，不同的細(xì)胞系培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF不僅可通過Ets1調(diào)節(jié)MMP9啟動(dòng)子而上調(diào)MMP9 mRNA的表達(dá)，還通過轉(zhuǎn)錄因子ELAF調(diào)節(jié)MMP2啟動(dòng)子。由此可知，VEGF、MMPs及Ets1、ELAF間存在相輔相成的關(guān)系，提示若VEGF濃度出現(xiàn)波動(dòng)則有可能對(duì)MMPs的表達(dá)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定濃度的As2O3不僅可下調(diào)K562/A02細(xì)胞VEGF的表達(dá)，而且可降低MMP2、9的活性。最近研究發(fā)現(xiàn)As2O3可通過下調(diào)NFκB的表達(dá)而抑制MMP的表達(dá)[14]。As2O3對(duì)MMPs 的抑制是否與其下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)，是否存在其他通路，尚有待于進(jìn)一步的研究。本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，As2O3在0.4μM和3.2μM濃度時(shí)可有效地下調(diào)白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02 VEGF的表達(dá)及MMP2、9的活性。As2O3對(duì)VEGF的下調(diào)作用及對(duì)MMP2、9活性的抑制作用可能是其抑制血液病腫瘤細(xì)胞血管新生的原因之一。

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