【關(guān)鍵詞】 腫瘤;多藥耐藥性;逆轉(zhuǎn)

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一。MDR是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象[1]。

1 腫瘤MDR產(chǎn)生的機(jī)制

MDR的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的多種途徑綜合作用的結(jié)果，其形成機(jī)制非常復(fù)雜，其產(chǎn)生機(jī)制如下。

1.1 膜糖蛋白介導(dǎo)的MDR

1.1.1 P糖蛋白介導(dǎo)的經(jīng)典MDR P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）是由多藥耐藥基因MDR1編碼的一種分子量為170kD的跨膜糖蛋白，它屬于典型的ABC(ATPbinding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員[2]。Pgp是一個ATP依賴性的藥物外排泵，能利用ATP水解釋放的能量主動將疏水親脂性化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低于殺傷濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR[3]。

1.1.2 多藥耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的MDR 多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是由1531個氨基酸組成的分子量為190kD的跨膜糖蛋白[4]。它與Pgp有某種程度上的序列同源性，同屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。MRP可通過促進(jìn)谷胱甘肽結(jié)合藥物從細(xì)胞內(nèi)的排出而產(chǎn)生MDR[5]。

1.1.3 乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的MDR 乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是由655個氨基酸組成的分子量為72.6kD的跨膜蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由一個疏水跨膜區(qū)和一個核苷酸結(jié)合區(qū)構(gòu)成。兩個BCRP分子通過二硫間形成同源或異源二聚體后才具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性[6]。BCRP可以降低阿霉素、柔紅霉素等在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累從而產(chǎn)生耐藥性[7]。

1.1.4 肺耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的MDR 肺耐藥相關(guān)蛋白（lung resistancerelated protein，LRP）是一種分子量為110kD的蛋白質(zhì)。LRP與Pgp、MRP、BCRP的作用機(jī)制不同，它主要通過核靶點(diǎn)屏蔽機(jī)制引起MDR，LRP可以使以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物不能通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，有些藥物即使進(jìn)入核內(nèi)也會很快被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中[8]。

1.2 酶介導(dǎo)的MDR

1.2.1 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的MDR 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathionestransferase，GST) 是一組與細(xì)胞解毒功能有關(guān)的酶，分為α、μ和π等多種同工酶，各由GST 超基因家族的相應(yīng)基因編碼。GST 通過催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)與藥物結(jié)合，使兩者形成復(fù)合物而解毒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。GST本身也可與親脂性藥物結(jié)合增加其水溶性，促進(jìn)外排而降低化療藥物的細(xì)胞毒作用，同樣也引起腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。烷化劑和鉑類藥物均可通過這一途徑解毒。

1.2.2 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的MDR 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomerase，TopoⅡ）是存在于細(xì)胞核內(nèi)催化DNA雙鏈拓?fù)洚悩?gòu)體相互轉(zhuǎn)換的基本核酶[9]，可改變DNA 的拓?fù)湫问剑瑓⑴cDNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等許多重要活動。研究表明，TopoⅡ介導(dǎo)的MDR表纖維耐藥細(xì)胞酶轉(zhuǎn)錄水平和活性降低，同時，TopoⅡ還可以參與特殊耐藥基因的調(diào)控，合成出具有特殊排泵功能的膜蛋白，將藥物泵出胞外，從而產(chǎn)生耐藥。一般說來，TopoⅡ異常所致的MDR有以下特點(diǎn)：①對許多天然藥物呈現(xiàn)抗藥性；②膜活性藥物不能提高抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用；③藥物在細(xì)胞內(nèi)聚積與外排無變化；④MDR1與Pgp表達(dá)未增加；⑤TopoⅡ含量及活性均有所下降。

1.2.3 蛋白激酶C介導(dǎo)的MDR 蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是由一個超基因家族編碼同源性很高的相關(guān)分子組成的一組酶，在MDR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PKC幾乎參與所有MDR機(jī)制的調(diào)節(jié)[10，11]。Pgp是PKC 催化磷酸化的底物，Pgp 磷酸化后可被激活，使其藥物外排功能增強(qiáng)。另外，PKC 也可使MRP、LRP、GST 和Topo II 磷酸化，分別增強(qiáng)它們的活性。

1.3 凋亡調(diào)控基因介導(dǎo)的MDR

多數(shù)化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(PCD) 即凋亡來達(dá)到治療目的，反之，腫瘤細(xì)胞也可通過逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產(chǎn)生多藥耐藥。目前研究比較多的是bcl2基因和p53基因。

1.3.1 bcl2基因 bcl2是最重要的細(xì)胞凋亡抑制基因，它位于18號染色體上（18q21）。bcl2基因過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的生存，同時也抑制放射線、化療藥物等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。bcl2基因轉(zhuǎn)染bcl2低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞bcl2表達(dá)增強(qiáng)，對大多數(shù)細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生耐受[12，13]。用針對bcl2 mRNA的反義寡核苷酸處理多發(fā)性骨髓瘤患者的惡性漿細(xì)胞，bcl2蛋白表達(dá)量減少，并伴有凋亡增加和對化療藥物的敏感性增加[14]。臨床上許多白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞中bcl2基因的表達(dá)較高者，往往同時伴有放、化療耐受。

1.3.2 p53基因 p53基因有野生型和突變型兩種存在形式。野生型p53被視為細(xì)胞生長的“監(jiān)控器”，能誘導(dǎo)DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入G1/S期，抑制細(xì)胞增殖直至損傷DNA得到修復(fù)，若修復(fù)失敗則誘導(dǎo)損傷細(xì)胞凋亡。當(dāng)p53基因發(fā)生突變、缺失導(dǎo)致表達(dá)異常時（突變型p53），其對凋亡的控制也會發(fā)生異常，這時化療藥物所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受顯著增強(qiáng)。同時基因的突變也可能特異性激活MDR1/Pgp啟動子使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR。

其他參與凋亡調(diào)控的基因如cmyc、ras、fas/apo1、bcr/abl、cerB2/neu等也與腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

1.4 DNA異常修復(fù)引起的MDR

DNA是傳統(tǒng)的化療藥物烷化劑和鉑類化合物的作用靶點(diǎn)，它們通過直接破壞DNA結(jié)構(gòu)的完整性引起DNA損傷而殺傷腫瘤細(xì)胞。這種DNA損傷的異常修復(fù)會使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。涉及以下機(jī)制：(1)腫瘤細(xì)胞DNA鳥嘌呤堿基第6位氧原子烷基化導(dǎo)致細(xì)胞突變死亡是烷化劑的重要?dú)麢C(jī)制。O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(06methylguanine DNA ethyltransferaes，MGMT)可將DNA中O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移至酶自身的半胱氨酸殘基上，通過修復(fù)烷化劑對細(xì)胞DNA的損傷使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。(2)核苷酸切割修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)是一種復(fù)雜的修復(fù)機(jī)制，能切除2729個堿基長度的DNA損害，理論上NER能切除任何使DNA雙螺旋產(chǎn)生較大變化的DNA損傷。(3)錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)能識別結(jié)構(gòu)正常的非配對堿基間錯配的微小改變。MMR系統(tǒng)缺陷使細(xì)胞識別DNA損傷的能力減弱，而不產(chǎn)生引起細(xì)胞凋亡的信號。MMR功能喪失導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性增加，產(chǎn)生對抗癌藥耐受的突變體。

2 腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)策略

隨著腫瘤細(xì)胞MDR分子基礎(chǔ)和發(fā)生機(jī)制研究的不斷深入，用不同手段和方法來克服腫瘤細(xì)胞的MDR已在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用方面有了很大進(jìn)展。目前常采用以下幾種逆轉(zhuǎn)策略。

2.1 化學(xué)藥物治療

針對腫瘤MDR的產(chǎn)生過程，應(yīng)用多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑是解決腫瘤MDR的主要手段。經(jīng)過二十多年的開發(fā)研究，已發(fā)現(xiàn)大量具有MDR逆轉(zhuǎn)活性的化合物，主要包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米及其衍生物)、鈣調(diào)蛋白抑制劑(噻吩嗪類化合物)、免疫抑制劑(環(huán)孢菌素A 及其衍生物)、類固醇和激素類似物(黃體酮、甲地孕酮) 等。但這類逆轉(zhuǎn)劑的毒副作用也使其臨床應(yīng)用受到限制。

2.2 天然藥物（中藥）治療

天然藥物具有低毒、資源豐富、作用靶點(diǎn)多等特點(diǎn)。近年來許多學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向天然藥物或中藥，探索天然的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑。研究證實(shí)有多種植物中藥具有逆轉(zhuǎn)MDR的作用，且逆轉(zhuǎn)方式各有特點(diǎn)。

中藥川芎嗪可下調(diào)MRP陽性表達(dá)率，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高而逆轉(zhuǎn)MDR[15]。人參皂甙可下調(diào)mdr1mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致其產(chǎn)物Pgp減少，從而使抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積增加[16]。漢防己甲素（TTD）不僅能明顯提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，且能明顯增強(qiáng)化療藥物致細(xì)胞凋亡的作用[17]。千金藤素（CEP）通過降低NF κB活性，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)MDR[18]。漏蘆抽提劑RHU通過促進(jìn)耐藥細(xì)胞株凋亡，抑制腫瘤耐藥基因MDR/ Pgp的表達(dá)從而顯著逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[19]。 冬凌草甲素可明顯誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，顯著地逆轉(zhuǎn)K256/ A02 細(xì)胞對柔紅霉素、高三尖杉酯堿的耐藥性[20]。蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿可競爭性地與Pgp結(jié)合，阻斷化療藥物外排而增強(qiáng)VCR對BEL7402細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[21]。浙貝母堿能直接抑制糖蛋白的表達(dá)，明顯提高由Pgp或MRP介導(dǎo)的耐藥腫瘤細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物濃度[22]。茶多酚能明顯增加MCF7 /ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性，且其耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能是Pgp[23]。槲皮素能夠下調(diào)MCF7/ADM細(xì)胞Pgp的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)MCF7/ADM細(xì)胞的MDR [24]。鴉膽子油乳通過競爭Pgp 對其他化療藥物的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制藥物泵出，在一定程度上逆轉(zhuǎn)K562/A02，MCF27/ADM，KB/VCR等細(xì)胞的耐藥性[25]。甲基蓮心堿可抑制Pgp 的功能和表達(dá)，減少藥物的外排從而克服MDR細(xì)胞的凋亡抗性[2627] 。葡萄籽多酚可能通過抑制Pgp 的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而在體內(nèi)、體外逆轉(zhuǎn)MCF7/ ADM細(xì)胞的耐藥性[2829]。欖香烯可下調(diào)抗凋亡基因bcl2的表達(dá)，促使耐藥細(xì)胞凋亡[30]。

目前中藥逆轉(zhuǎn)劑的研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，而對于其在體內(nèi)的作用效果及安全性仍有待進(jìn)一步的在體研究來驗(yàn)證。這在一定程度上也阻礙了中藥在逆轉(zhuǎn)MDR方面前進(jìn)的步伐及其在臨床的應(yīng)用。

2.3 基因治療

基因治療是腫瘤治療的新方法，MDR的基因治療研究主要集中在MDR1 基因及某些癌相關(guān)基因。反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)及RNA干擾技術(shù)給耐藥逆轉(zhuǎn)提供了新的高效特異性的方法，較傳統(tǒng)的MDR 逆轉(zhuǎn)方法有較多優(yōu)勢。

2.3.1 反義寡核苷酸技術(shù) 反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)是指用一段人工合成的能與RNA或DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸鏈來抑制基因的表達(dá)。應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)治療MDR就是用一段人工合成的能與耐藥相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平上相結(jié)合的核苷酸來封閉多藥耐藥基因轉(zhuǎn)錄，從而改變其MDR 特性。

將MDR1基因的ASODN 導(dǎo)入表達(dá)MDR1基因的耐藥細(xì)胞后都可明顯下調(diào)Pgp的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度[31]。將ASODN的3'端與阿霉素共價連接后作用于KBA1細(xì)胞，可使KBA1細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度比單用阿霉素組高6.4倍，比單用ASODN組高1.8倍[32]。應(yīng)用MRP ASODN可下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF7/VP中MRP mRNA 表達(dá)[33]。多細(xì)胞卵巢癌球狀體有高水平P27和Pgp表達(dá)，而且其對紫杉醇的耐藥性較單層卵巢癌細(xì)胞更強(qiáng)。應(yīng)用ASODN技術(shù)可以下調(diào)多細(xì)胞卵巢癌球狀體中P27和Pgp表達(dá)，從而增強(qiáng)其對紫杉醇的敏感性[34]。當(dāng)然，反義寡核苷酸較短的半衰期及較高的制備成本也使其廣泛應(yīng)用受到一定限制。

2.3.2 反義RNA技術(shù) 反義RNA技術(shù)指利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建人工表達(dá)載體，使其體外或體內(nèi)表達(dá)反義RNA，從而抑制靶基因的表達(dá)。反義RNA是與多藥耐藥相關(guān)基因的mRNA形成二聚體而抑制mRNA翻譯，從而逆轉(zhuǎn)MDR。陳琳等[35] 應(yīng)用自行構(gòu)建的攜帶反義MRP的重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC7721/ADM，使ADM、DNR對SMMC7721/ADM細(xì)胞的IC50分別為0.487μg/ml、0.328μg/ml，RF值分別為97.4、109.3，轉(zhuǎn)染后24h，MRP mRNA水平開始下降并呈持續(xù)下降趨勢，48h后伴有MRP蛋白表達(dá)的持續(xù)下降。表明MRP反義RNA可有效封閉MRP基因表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細(xì)胞的MDR。陳綱等[36] 研究發(fā)現(xiàn)草酸鉑、5Fu聯(lián)合MDR1反義RNA對直腸癌耐藥細(xì)胞有協(xié)同殺傷作用，可望成為治療對5Fu耐藥的直腸癌的有效方法。還有研究顯示，MDR1反義RNA能下調(diào)人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC7721/ADM中MDR1 mRNA和Pgp表達(dá)，使阿霉素和柔紅霉素對SMMC7721/ADM細(xì)胞的IC50分別下降了31.25%和62.96%[37]。反義RNA技術(shù)能夠提高化療藥物的敏感性，有效逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR。

2.3.3 核酶技術(shù) 核酶是一類具有催化活性的RNA分子，它能特異性地識別mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪切反應(yīng)，而其自身不被消耗可重復(fù)使用，具有高效率、高特異性、少副作用等特點(diǎn)。

特異性切割bcl2 mRNA 的核酶可有效地阻斷bcl2 蛋白合成，明顯促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，提高紫杉醇化療效果，克服耐藥[38]。Kowalski等[39]用具有催化活性的抗BCRP的核酶處理257RNOV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)257RNOVRzB1中BCRP mRNA 水平顯著降低，米托蒽醌I(xiàn)C50 ( the 50% inhibitory concentration) 值也明顯降低。王海等[40]利用核酶技術(shù)切割腫瘤多藥耐藥基因(MDR1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗MDR1核酶處理的人肝癌耐藥細(xì)胞株Hep G2 MDR1 mRNA、Pgp明顯降低，細(xì)胞內(nèi)羅丹明聚集，對阿霉素的敏感性提高200倍。針對MDR1mRNA的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計的核酶（RZ135和RZ106）能夠下調(diào)乳腺癌耐藥細(xì)胞中MDR1mRNA和Pgp的表達(dá)，抑制Pgp的外排功能[41]。

2.3.4 RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNA interference，RNAi)是含21～23個核苷酸的小分子干擾RNA 片段(small interference RNAs，siRNA) 特異性地識別并降解其同源基因mRNA，誘導(dǎo)序列特異性基因沉默的過程。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到基因功能、基因表達(dá)調(diào)控等熱門領(lǐng)域，為基因治療開辟了新的途徑。

張曉菁等[42]用脂質(zhì)體介導(dǎo)將MDR1特異性siRNA的表達(dá)載體(pSN/ mdr1a 和pSN/ mdr1b) 轉(zhuǎn)染阿霉素耐藥細(xì)胞株OVCAR/ AR和多藥耐藥亞株OVCAR/MDR細(xì)胞，可顯著抑制兩株耐藥細(xì)胞MDR1 mRNA 和Pgp的表達(dá)，OVCAR/MDR 和OVCAR/AR 細(xì)胞對阿霉素抗藥性的逆轉(zhuǎn)率分別為79.5%和93.9%。表明載體表達(dá)的MDR1特異性siRNA可抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞MDR1基因的表達(dá)，增加耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性。轉(zhuǎn)錄相關(guān)鋅帶蛋白基因(zinc ribbon domaincontaining 1 protein，ZNRD1) 可能通過類似轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用參與腫瘤多藥耐藥[43]，樸瑛等[44]構(gòu)建了ZNRD1 基因的siRNA 載體并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入HL60/VCR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對長春新堿和阿霉素的敏感性增強(qiáng)，且低表達(dá)Pgp 和bcl2 ，該siRNA真核表達(dá)載體在一定程度上逆轉(zhuǎn)了白血病細(xì)胞的耐藥性。抗ABCG2的siRNA和短發(fā)夾RNA可完全抑制ABCG2 mRNA及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，而且抗ABCG2的短發(fā)夾RNA使耐藥細(xì)胞中化療藥物濃度累積到親代敏感細(xì)胞水平[45]。與傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)相比，RNAi設(shè)計更簡便、作用更迅速、效果更明顯。

3 展望

腫瘤多藥耐藥的問題仍然是目前臨床治療所面臨的主要困難之一，對其進(jìn)行全面深入的研究將有助于惡性腫瘤的治療。臨床逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)的根本性突破，還有待于MDR機(jī)制的進(jìn)一步明確。隨著高效低毒逆轉(zhuǎn)劑的不斷發(fā)現(xiàn)以及基因治療技術(shù)的不斷發(fā)展并逐漸應(yīng)用于臨床，腫瘤對化療藥物的耐藥性將會被克服。

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