【摘要】 目的 探討三氧化二砷（As2O3）對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901/ADR阿霉素（ADM）耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用和對(duì)Pgp、GSTπ表達(dá)的影響。方法 以胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR為靶細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)藥物濃度及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá)。結(jié)果 0.4～0.8μmol/L As2O3對(duì)耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR無明顯毒性(P>0.05)。As2O3可下調(diào)Pgp、GSTπ表達(dá)，提高SGC7901/ADR細(xì)胞內(nèi)ADM濃度，增加SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性。結(jié)論 As2O3能夠抑制SGC7901/ADR細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)ADM藥物濃度而部分逆轉(zhuǎn)其對(duì)ADM的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】 胃癌 SGC7901細(xì)胞株 SGC7901/ADR細(xì)胞株 多藥耐藥 三氧化二砷

0 引言 三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）注射液主要用于治療急性早幼粒白血病。最近研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可引起白血病細(xì)胞K562/ADR Pgp表達(dá)下調(diào)，使其多藥耐藥性部分逆轉(zhuǎn)，具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的作用[1]；而As2O3對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞株SGC7901/ADR是否具有相同作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以SGC7901/ADR細(xì)胞為研究對(duì)象，通過MTT法、流式細(xì)胞儀和免疫組織化學(xué)等方法研究As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用及可能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 As2O3（即亞砷酸注射液，哈爾濱伊達(dá)制藥有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H：19990191；批號(hào)：021031），MTT（美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品），鹽酸阿霉素（ADM）（浙江海正藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980，批號(hào)：021005），鼠抗人Pgp、GSTπ單克隆抗體及即用型第二代免疫組化ElivisionTM plus廣譜試劑盒（福州Maixin生物工程公司產(chǎn)品）。

1.1.2 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SGC7901和SGC7901/ADR，由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化內(nèi)科研究所惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 As2O3細(xì)胞毒性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，加入不同濃度的As2O3(3.2～0.1μmol/L)，參照文獻(xiàn)[2]說明進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選取細(xì)胞存活率>90％的藥物濃度為該藥的非細(xì)胞毒性濃度。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞藥物敏感性 實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，按前述方法培養(yǎng)細(xì)胞48 h，測(cè)定A490nm值。分組如下：（1）SGC7901（或SGC7901/ADR）細(xì)胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）；（2）SGC7901（或SGC7901/ADR）細(xì)胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）+As2O3（0.4μmol/L，終濃度）；（3）SGC7901（或SGC7901/ADR）細(xì)胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）+As2O3（0.8μmol/L，終濃度）。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，按前述方法培養(yǎng)細(xì)胞24h，按照文獻(xiàn)[3]采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度。分組如下:（1）加入ADM（5mg/L，終濃度）；（2）加入As2O3（0.4μmol/L，終濃度）和ADM（5mg/L，終濃度）；（3）加入As2O3（0.8μmol/L，終濃度）和ADM（5mg/L，終濃度）。

1.2.4 用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行：（1）SGC7901；（2）SGC7901/ADR；（3）SGC7901/ADR+As2O3（0.8μmol/L，終濃度）。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/ml滴于處理過的載玻片上，培養(yǎng)4h。按Elivision二步法免疫組織化學(xué)試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的t檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 As2O3的細(xì)胞毒作用 As2O3在0.8μmol/L和0.4μmol/L時(shí)，耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR的存活率分別為93.92％和95.84％；相同劑量的As2O3對(duì)敏感細(xì)胞SGC7901也無明顯細(xì)胞毒性。故將0.8μmol/L和0.4μmol/L作為非細(xì)胞毒性藥物濃度。

2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞藥物敏感性 0.8μmol/L和0.4μmol/L As2O3與ADM同時(shí)作用，可降低耐藥細(xì)胞的存活率，增加耐藥細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.11和1.58（P<0.01）。與0.4μmol/L As2O3相比，0.8μmol/L的As2O3能顯著增加耐藥細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性（P<0.05）；而As2O3對(duì)敏感細(xì)胞卻無增敏作用（P>0.05），見表1。

表1 As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞ADM耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（略）

★:vs SGC7901; ☆:vs SGC7901/ADR

2.3 As2O3對(duì)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的影響 通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度， 分析As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的影響。 由表2可見，SGC7901/ADR細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度比SGC7901低4.65倍(P<0.05)； 加入0.4μmol/L As2O3后，SGC7901/ADR細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度無顯著性增加(P>0.05)；加入0.8μmol/LAs2O3后，耐藥細(xì)胞內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度明顯增加（P<0.01），增加倍數(shù)為1.32倍。

2.4 As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá)的影響 耐藥細(xì)胞的Pgp、GSTπ表達(dá)明顯高于敏感細(xì)胞（P<0.01），加入As2O3后，耐藥細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá)明顯降低（P<0.05），見表3。

表2 As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度的影響（略）

★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR

表3 As2O3對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞Pgp、GSTπ表達(dá)的影響（略）

★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR 3 討論 腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的多藥耐藥性（MDR）是臨床上的棘手問題，尤其在實(shí)體瘤中更為突出。各種研究表明，腫瘤細(xì)胞MDR的產(chǎn)生是由多種因素共同作用的結(jié)果，其中腫瘤細(xì)胞膜上的藥物外流泵向外排出藥物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低是引起MDR的主要原因， Pgp作為ABC家族的主要成員在化療后表達(dá)增加，部分解釋了MDR產(chǎn)生的原因[4]。人們?cè)谔接慚DR發(fā)生機(jī)制的同時(shí)，也在尋找更為有效的逆轉(zhuǎn)劑。我們研究發(fā)現(xiàn)0.4～0.8μmol/L的As2O3對(duì)細(xì)胞無明顯毒性(P<0.01)，可降低Pgp表達(dá)（P<0.05），增加細(xì)胞內(nèi)ADM濃度（P<0.05），提高耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR對(duì)ADM的敏感性。因此我們推斷As2O3部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性與降低Pgp表達(dá)，抑制ADM外流有關(guān)。 GST是一類參與化療藥的解毒、降低脂酯過氧化及修復(fù)DNA損傷有關(guān)的酶，在氮芥類化合物及ADM耐藥細(xì)胞株中的改變最為顯著[5]。As2O3具有與細(xì)胞內(nèi)GSH結(jié)合的作用，從而降低As2O3的細(xì)胞毒性，同樣也可與GSTπ內(nèi)的巰基結(jié)合抑制其活性，從而降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量，而MRP是一種GSH偶聯(lián)的外流泵[6]，那么As2O3是否能夠通過抑制GSTπ活性來影響MRP功能從而部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性呢？在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.8μmol/ml As2O3可顯著降低SGC7901/ADR細(xì)胞GSTπ表達(dá)（P<0.05），因此，我們推測(cè)As2O3通過抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)GSTπ的表達(dá)參與了對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞ADM耐藥性的部分逆轉(zhuǎn)作用。 本實(shí)驗(yàn)研究表明，As2O3可降低Pgp和GSTπ表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)ADM濃度，部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR胃癌細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性，且逆轉(zhuǎn)濃度遠(yuǎn)低于臨床血藥濃度，是具有臨床應(yīng)用價(jià)值的新型逆轉(zhuǎn)劑。然而腫瘤細(xì)胞的MDR是由多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，涉及到多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變、解毒系統(tǒng)的激活、凋亡通路的改變、DNA修復(fù)系統(tǒng)的增強(qiáng)等等，特別是多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同轉(zhuǎn)運(yùn)一種抗癌藥形成的耐藥性是導(dǎo)致目前的逆轉(zhuǎn)劑只能部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的重要原因。隨著人們對(duì)多藥耐藥機(jī)制的不斷深入研究及新的不同機(jī)制的逆轉(zhuǎn)劑的出現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用As2O3和不同作用機(jī)制的逆轉(zhuǎn)劑將會(huì)更有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

【參考文獻(xiàn)】 ［1］ WEI Hulai，SU Haixiang， BAI Decheng，et al.Arsenic trioxide inhibits pglycoprotein expression in multidrugresistant human leukemia cells that overexpress the MDR1 gene［J］.Chin Med J， 2003，116 (11):16441648. ［２］ Lin HL.Liu TY，Wu CW，et al.Berberine modulates expression of mdr1 gene product and the responses of digestive track cancer cells to Paclitaxel［J］. Br J Cancer，1999，81(3):416422. ［3］ Tanaka S，Aizawa K，Katayangi N，et al.Flow cytometric analysis of early steps in development of adriamycin resistance in a human gastric cancer cell line［J］. Jpn J Cancer Res，1994，85(1):8692. ［４］ Ramesh S， Shanthi P， Krishnan KB，et al.Multidrug resistance 1 gene expression in Indian patients with gastric carcinoma［J］. Indian J Gastroenterol，2003，22(1):1921. ［5］ Mattern J，Koomagi R，Volm M.Expression of drug resistance gene products during progression of lung carcinomas［J］. Oncology Reports，2002，9(6):11811184. ［６］ Saengkhae C，Loetchutinat C，GarnierSuillerot A.Kinetic analysis of rhodamines efflux mediated by the multidrug resistance protein (MRP1)［J］.Biophys J，2003，85(3):20062014.