【摘要】 目的 探討三氧化二砷（As2O3）對胃癌細胞SGC7901/ADR阿霉素（ADM）耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用和對Pgp、GSTπ表達的影響。方法 以胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/ADR為靶細胞，用MTT法檢測SGC7901/ADR細胞對ADM的敏感性，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)藥物濃度及免疫組織化學法檢測細胞Pgp、GSTπ表達。結(jié)果 0.4～0.8μmol/L As2O3對耐藥細胞SGC7901/ADR無明顯毒性(P<0.01)。As2O3可下調(diào)Pgp、GSTπ表達，提高SGC7901/ADR細胞內(nèi)ADM濃度，增加SGC7901/ADR細胞對ADM的敏感性。結(jié)論 As2O3能夠抑制SGC7901/ADR細胞Pgp、GSTπ表達，增加細胞內(nèi)ADM藥物濃度而部分逆轉(zhuǎn)其對ADM的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】 胃癌 SGC7901細胞株 SGC7901/ADR細胞株 多藥耐 三氧化二砷

0 引言 三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）注射液主要用于治療急性早幼粒白血病。最近研究發(fā)現(xiàn)，As2O3可引起白血病細胞K562/ADR Pgp表達下調(diào)，使其多藥耐藥性部分逆轉(zhuǎn)，具有增強腫瘤細胞化療敏感性的作用[1]；而As2O3對實體瘤細胞株SGC7901/ADR是否具有相同作用還未見報道。本實驗以SGC7901/ADR細胞為研究對象，通過MTT法、流式細胞儀和免疫組織化學等方法研究As2O3對SGC7901/ADR細胞的逆轉(zhuǎn)作用及可能的機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 As2O3（即亞砷酸注射液，哈爾濱伊達制藥有限公司產(chǎn)品，批準文號：國藥準字H：19990191；批號：021031），MTT（美國Sigma公司產(chǎn)品），鹽酸阿霉素（ADM）（浙江海正藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批準文號：國藥準字H33021980，批號：021005），鼠抗人Pgp、GSTπ單克隆抗體及即用型第二代免疫組化ElivisionTM plus廣譜試劑盒（福州Maixin生物工程公司產(chǎn)品）。

1.1.2 細胞 人胃癌細胞株SGC7901和SGC7901/ADR，由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院全軍消化內(nèi)科研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 As2O3細胞毒性測定 取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，加入不同濃度的As2O3(3.2～0.1μmol/L)，參照文獻[2]說明進行，每個實驗重復(fù)3次，選取細胞存活率>90％的藥物濃度為該藥的非細胞毒性濃度。

1.2.2 MTT法測定細胞藥物敏感性 實驗分3組進行，按前述方法培養(yǎng)細胞48 h，測定A490nm值。分組如下：（1）SGC7901（或SGC7901/ADR）細胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）；（2）SGC7901（或SGC7901/ADR）細胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）+As2O3（0.4μmol/L，終濃度）；（3）SGC7901（或SGC7901/ADR）細胞+ADM（0.01～100mg/L，終濃度）+As2O3（0.8μmol/L，終濃度）。

1.2.3 細胞內(nèi)ADM熒光強度測定 實驗分3組進行，按前述方法培養(yǎng)細胞24h，按照文獻[3]采用流式細胞儀測定細胞內(nèi)ADM熒光強度。分組如下:（1）加入ADM（5mg/L，終濃度）；（2）加入As2O3（0.4μmol/L，終濃度）和ADM（5mg/L，終濃度）；（3）加入As2O3（0.8μmol/L，終濃度）和ADM（5mg/L，終濃度）。

1.2.4 用免疫組織化學方法測定細胞Pgp、GSTπ表達 實驗分3組進行：（1）SGC7901；（2）SGC7901/ADR；（3）SGC7901/ADR+As2O3（0.8μmol/L，終濃度）。調(diào)整細胞數(shù)為1×105/ml滴于處理過的載玻片上，培養(yǎng)4h。按Elivision二步法免疫組織化學試劑盒說明進行。

1.2.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件中的t檢驗作統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 As2O3的細胞毒作用 As2O3在0.8μmol/L和0.4μmol/L時，耐藥細胞SGC7901/ADR的存活率分別為93.92％和95.84％；相同劑量的As2O3對敏感細胞SGC7901也無明顯細胞毒性。故將0.8μmol/L和0.4μmol/L作為非細胞毒性藥物濃度。

2.2 MTT法測定細胞藥物敏感性 0.8μmol/L和0.4μmol/L As2O3與ADM同時作用，可降低耐藥細胞的存活率，增加耐藥細胞對ADM的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.11和1.58（P<0.01）。與0.4μmol/L As2O3相比，0.8μmol/L的As2O3能顯著增加耐藥細胞對ADM的敏感性（P<0.05）；而As2O3對敏感細胞卻無增敏作用（P>0.05），見表1。

表1 As2O3對SGC7901/ADR細胞ADM耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（略）

★:vs SGC7901; ☆:vs SGC7901/ADR

2.3 As2O3對細胞內(nèi)ADM濃度的影響 通過流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ADM熒光強度， 分析As2O3對SGC7901/ADR細胞內(nèi)ADM濃度的影響。 由表2可見，SGC7901/ADR細胞內(nèi)ADM熒光強度比SGC7901低0.92倍(P<0.05)； 加入0.4μmol/L As2O3后，SGC7901/ADR細胞對ADM的敏感性增加0.19倍，但無顯著性增加(P>0.05);加入0.8μmol/LAs2O3后，耐藥細胞內(nèi)ADM的熒光強度明顯增加（P<0.01），增加倍數(shù)為0.45倍。

2.4 As2O3對SGC7901/ADR細胞Pgp、GSTπ表達的影響 耐藥細胞的Pgp、GSTπ表達明顯高于敏感細胞（P<0.01），加入As2O3后，耐藥細胞Pgp、GSTπ表達明顯降低（P<0.05），見表3。

表2 As2O3對SGC7901/ADR細胞內(nèi)ADM熒光強度的影響（略）

★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR

表3 As2O3對SGC7901/ADR細胞Pgp、GSTπ表達的影響（略）

★：vs SGC7901;☆:vs SGC7901/ADR 3 討論 腫瘤細胞對化療藥的多藥耐藥性（MDR）是臨床上的棘手問題，尤其在實體瘤中更為突出。各種研究表明，腫瘤細胞MDR的產(chǎn)生是由多種因素共同作用的結(jié)果，其中腫瘤細胞膜上的藥物外流泵向外排出藥物，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度降低是引起MDR的主要原因， Pgp作為ABC家族的主要成員在化療后表達增加，部分解釋了MDR產(chǎn)生的原因[4]。人們在探討MDR發(fā)生機制的同時，也在尋找更為有效的逆轉(zhuǎn)劑。我們研究發(fā)現(xiàn)0.4～0.8μmol/L的As2O3對細胞無明顯毒性(P<0.01)，可降低Pgp表達（P<0.05），增加細胞內(nèi)ADM濃度（P<0.05），提高耐藥細胞SGC7901/ADR對ADM的敏感性。因此我們推斷As2O3部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR細胞對ADM的耐藥性與降低Pgp表達，抑制ADM外流有關(guān)。 GST是一類參與化療藥的解毒、降低脂酯過氧化及修復(fù)DNA損傷有關(guān)的酶，在氮芥類化合物及ADM耐藥細胞株中的改變最為顯著[5]。As2O3具有與細胞內(nèi)GSH結(jié)合的作用，從而降低As2O3的細胞毒性，同樣也可與GSTπ內(nèi)的巰基結(jié)合抑制其活性，從而降低細胞內(nèi)GSH含量，而MRP是一種GSH偶聯(lián)的外流泵[6]，那么As2O3是否能夠通過抑制GSTπ活性來影響MRP功能從而部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性呢？在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)0.8μmol/ml As2O3可顯著降低SGC7901/ADR細胞GSTπ表達（P<0.05），因此，我們推測As2O3通過抑制腫瘤細胞內(nèi)GSTπ的表達參與了對SGC7901/ADR細胞ADM耐藥性的部分逆轉(zhuǎn)作用。 本實驗研究表明，As2O3可降低Pgp和GSTπ表達，增加細胞內(nèi)ADM濃度，部分逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR胃癌細胞對ADM的耐藥性，且逆轉(zhuǎn)濃度遠低于臨床血藥濃度，是具有臨床應(yīng)用價值的新型逆轉(zhuǎn)劑。然而腫瘤細胞的MDR是由多種因素、多種機制共同作用的結(jié)果，涉及到多種轉(zhuǎn)運蛋白的改變、解毒系統(tǒng)的激活、凋亡通路的改變、DNA修復(fù)系統(tǒng)的增強等等，特別是多種轉(zhuǎn)運蛋白共同轉(zhuǎn)運一種抗癌藥形成的耐藥性是導(dǎo)致目前的逆轉(zhuǎn)劑只能部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的重要原因。隨著人們對多藥耐藥機制的不斷深入研究及新的不同機制的逆轉(zhuǎn)劑的出現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用As2O3和不同作用機制的逆轉(zhuǎn)劑將會更有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。