【摘要】 探討Genistein對耐藥卵巢癌細胞SKOV3增殖、凋亡和順鉑敏感性的影響。方法 采用MTT法檢測Genistein單用及合用順鉑對細胞增殖的影響，流式細胞儀分析Genistein及Genistein聯合順鉑對細胞周期和凋亡的影響。結果 Genistein對SKOV3細胞增殖表現出濃度依賴性的抑制作用，并顯著提高了其對順鉑的敏感性（P<0.05）；0.625～5μg/ml順鉑與2.5～10μg/ml Genistein合用基本表現為協同作用。5、10μg/ml Genistein均可將細胞阻滯于G2/M期并誘導一定程度的凋亡，10μg/ml Genistein還可進一步的干擾S期進程；當順鉑與Genistein合用時，兩種藥物在干擾SKOV3細胞周期和誘導凋亡方面表現為顯著的協同效應。結論 Genistein能夠抑制耐藥卵巢癌細胞SKOV3的增殖，并顯著增強該細胞對順鉑的敏感性。

【關鍵詞】 Genistein 順鉑 卵巢癌 耐藥

0 引言 腫瘤耐藥是卵巢癌患者生存率低的重要原因，因此迫切需要新型有效的化療方案。Genistein（又稱染料木黃酮）是一種有潛力的化療增敏劑，廣泛存在于大豆和多種中草藥中，具有預防腫瘤的作用。近來研究表明Genistein還可以增強多種耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[1，2]，但Genistein是否可以增強耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性尚未見報道。本文從增殖、凋亡和順鉑敏感性方面分析了Genistein對耐藥卵巢癌細胞SKOV3的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV3，由本科實驗室保存，該細胞系對順鉑等多種藥物耐藥[3]。Genistein、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma，Genistein用DMSO配成儲備液（10mg/ ml），20℃保存；順鉑（齊魯制藥廠）；噻唑藍(MTT)購自Amresco。細胞周期試劑盒為DNAPrep Stain kit(BECKMANCOULTER)；Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒為Apoptosis Detection Kit(Biovision)。全自動酶標儀為Wellscan MK3型(Labsystems Dragon)；流式細胞儀為ELITE ESP型（BECKMANCOULTER）。

1.2 方法

1.2.1 順鉑、Genistein單藥對SKOV3細胞增殖的影響 收集對數生長期細胞，8×103個/孔接種于96孔培養板，37℃、50ml/L CO2孵箱培養12h，細胞貼壁后棄去培養液，加入含不同濃度藥物的培養基200μl，順鉑組濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml，Genistein組濃度為2.5、5、10、20、40、80μg/ml， 為評估DMSO對實驗的影響，設6個DMSO組（濃度與Genistein各組DMSO含量一致），同時設對照組，每組設6個復孔。繼續培養72h，每孔加入MTT(5mg/ml，20μl)，繼續孵育4h后棄培養液，每孔加入DMSO150μl，振蕩10min，酶標儀測吸光度(A490)，按以下公式計算：細胞增殖抑制率=（對照組A490值實驗組A490值）/對照組A490值× 100%，取6孔均值繪制濃度效應曲線。

1.2.2 順鉑聯合Genistein對SKOV3細胞增殖的影響 方法基本同前。順鉑選0.625、1.25、2.5、5μg/ml 4個濃度; Genistein選2.5、5、10、20、40μg/ml 5個濃度，設對照、單藥、聯合共30種組合。用以下公式計算兩藥的相互作用: q=E(AB)/[EA+EBEA×EB]。其中E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA和EB為各藥單用的抑制率，q>1.15為協同作用，0.85<1.15為相加作用，Q<0.85為拮抗作用。< p>

1.2.3 順鉑、Genistein單藥及聯合對周期和凋亡的影響 根據MTT結果，順鉑濃度選2.5μg/ml， Genistein選5.0、10.0μg/ml，設對照、單藥和聯合共6組。加藥48h后收集細胞，分別按DNAPrep Stain Kit試劑盒和Apoptosis Detection Kit試劑盒說明書進行細胞固定、染色，上流式細胞儀分析。

1.3 統計方法 采用SPSS10.0進行統計學處理。

2 結果

2.1 順鉑、Genistein單藥對SKOV3細胞增殖的影響 順鉑對SKOV3細胞增殖的抑制作用隨濃度的增加呈平緩的增強趨勢，當濃度達10μg/ml以上時，順鉑對增殖的抑制率才急劇上升，并在20μg/ml時達到51.6%，見圖1，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。而順鉑在2.5μg/ml濃度以下時，對SKOV3細胞增殖的抑制作用與對照組無顯著差異(P>0.05)。 Genistein對SKOV3細胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性，5μg/ml以上的各組與對照組差異顯著(P<0.01)，當Genistein濃度達40μg/ml后，抑制率急劇上升，80μg/ml Genistein的抑制率達到96.9%。而用于溶解Genistein的DMSO對SKOV3細胞增殖并無明顯影響(P=0. 398)，見圖2。

圖1 順鉑抑制耐藥卵巢癌細胞系skov3增殖的濃度效應曲線（略）

圖2 Genistein抑制耐藥卵巢癌細胞系skov3增殖的濃度效應曲線（略）

2.2 順鉑、Genistein聯用對SKOV3細胞增殖的影響

表1 順鉑聯合Genistein對SKOV3細胞增殖的抑制率（略）

2.3 Genistein、順鉑單藥及聯用對SKOV3細胞周期和凋亡率的影響 正常的SKOV3細胞絕大多數處于G1期；2.5μg/ml順鉑對SKOV3細胞周期無明顯影響；5μg/ml和10μg/ml Genistein分別使G2/M期SKOV3細胞比例增加至15.3%、15.9%，10μg/ml還可使S期細胞比例升高至25.9%；當順鉑與Genistein聯合作用時，可使G2/M期阻滯得到顯著加強，分別達67%和64.4%，順鉑合用10μg/ml Genistein還可進一步將部分細胞阻滯于S期，見圖3。

表2 順鉑聯合Genistein抑制SKOV3細胞增殖的協同作用值（q值）（略）

對照組凋亡率為2.6%；2.5μg/ml順鉑、5μg/ml Genistein對SKOV3細胞凋亡率無明顯影響，分別為3.1%、3.2%，10μg/ml Genistein可使凋亡率增加至6.4%；當2.5μg/ml順鉑與以上2種濃度Genistein聯合作用時，凋亡率的明顯升高，分別達到9.1%和20.8%。

圖3 順鉑聯合Genistein對SKOV3細胞周期的影響（略） 3 討論

3.1 Genistein對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響 Gercel等[4]研究Genistein對五種卵巢癌細胞系的影響，發現2.5μg/ml Genistein的抑制率為0%～23%，在39μg/ml Genistein作用下可以達到50%～80%；而且所有濃度的Genistein均誘導了Caspase3的表達，造成不同程度的凋亡。但Genistein對耐藥卵巢癌細胞系作用如何呢？本實驗發現5μg/ml以上濃度的Genistein對耐藥卵巢癌細胞SKOV3具有明確的增殖抑制作用，當Genistein濃度達40μg/ml以上時，抑制作用呈現急劇上升趨勢，80μg/ml幾乎能完全抑制癌細胞的增殖。 Mansour等[5]研究發現，Genistein能將惡性B細胞瘤阻斷在細胞周期的G2/M期，從而抑制細胞增殖并誘導凋亡，其作用主要是通過下調細胞周期蛋白cdc25C、cdk1， 并抑制抗凋亡蛋白survivin和Ian5的表達。本實驗也發現Genistein可將SKOV3細胞阻滯于G2/M期，并誘導一定程度的細胞凋亡；另外還發現10μg/ml Genistein可同時阻滯部分細胞于S期，具體機制尚不清楚。

3.2 Genistein對SKOV3細胞順鉑敏感性的影響 Genistein除了本身的抗腫瘤活性外，尚可在一定程度上逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，起到化療增敏作用，該作用主要與其可下調耐藥腫瘤細胞內過多表達的抗凋亡蛋白bcl2、bclXL等有關。如Genistein可誘導耐藥乳腺癌細胞系凋亡，其作用和降低抗凋亡蛋白bcl2的表達相關 [1]；Genistein也可通過降低抗凋亡因子bclXL的表達，逆轉人前列腺癌細胞系PC3對十字孢堿的耐藥 [2]。本實驗中發現SKOV3細胞明顯對順鉑耐藥，血清峰值濃度（2.5μg/ml）以下的順鉑對SKOV3細胞增殖未見明顯影響，這與文獻報道基本一致[3]。但與Genistein合用時，血清峰值濃度以下的順鉑明顯地抑制了SKOV3細胞的增殖。干擾細胞周期并誘導凋亡是順鉑治療腫瘤的重要途徑，而血漿峰值濃度的順鉑對SKOV3細胞周期和凋亡率幾乎無影響，但與Genistein合用時，可引起細胞G2/M期高度阻滯，相應的凋亡率也明顯升高；與10μg/ml Genistein合用還進一步干擾了細胞的S期進程。 綜上所述，Genistein對耐藥卵巢癌細胞SKOV3呈現濃度依賴性的增殖抑制作用，并改善了SKOV3細胞對順鉑的敏感性，增強順鉑的抑制、殺傷作用。Genistein自大豆等天然食物中提取，Ⅰ期臨床試驗中除偶見皮疹外，未見任何嚴重的毒副反應[6]，因而很有希望成為臨床治療卵巢癌的輔助藥物。關于Genistein增強耐藥卵巢癌對順鉑敏感性的具體機制還有待進一步研究。