【摘要】 目的 檢測非小細胞肺癌（NSCLC）中凋亡蛋白survivin、bcl2、bax與多藥耐藥有關基因MDR1mRNA和MRPmRNA的表達，探討其相互關系及意義。方法 選取113例NSCLC病例，采用原位分子雜交檢測MDR1和MRP基因mRNA的表達，SP免疫組化法檢測survivin、bcl2、bax蛋白的表達。結果 113例NSCLC中，MDR1mRNA、MRPmRNA及survivin、bcl2、bax蛋白的檢出率分別為51.3%、80.5%、79.6%、59.3%、54.9%。survivin和bax的表達與腫瘤分化程度有關（P＜0.05），bcl2的表達與腫瘤組織學類型有關（P＜0.01）。MDR1mRNA與MRPmRNA（P＜0.01）、survivin與MDR1mRNA（P＜0.05）、bcl2與MRPmRNA（P＜0.05）表達之間存在明顯相關性。結論 凋亡抑制蛋白survivin的高表達和bcl2的過表達可能是導致NSCLC原發耐藥的重要因素，檢測survivin和bcl2對臨床逆轉 NSCLC多藥耐藥性具有指導意義。

【關鍵詞】 肺腫瘤 多藥耐藥 細胞凋亡 原位雜交 免疫組織化學

0 引言 多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）是影響非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）化療效果的主要原因。大量研究表明，多藥耐藥機制是多因素作用、多基因改變的復雜過程。近年來，除經典的耐藥途徑外，細胞凋亡抑制與多藥耐藥的關系日益受到重視。本實驗選取了113例未經治療的NSCLC病例，用原位雜交法檢測MDR1和MRPmRNA的表達，SP免疫組化法檢測3種凋亡相關蛋白（survivin、bcl2和bax）的表達，旨在觀察NSCLC中多藥耐藥與細胞凋亡的關系并進一步探討多藥耐藥產生的其他機制。

1 資料與方法

1．1 資料 收集武漢大學中南醫院病理科1996～2000年間手術切除并經病理確診的NSCLC共113例，所有病例術前均未經放化療。其中男性91例，女性22例。年齡34～77歲，均齡56歲。鱗癌39例，腺癌61例（含細支氣管肺泡癌16例），腺鱗癌13例。高分化43例，中分化47例，低分化23例。根據1997年肺癌國際分期修正系統公布的TNM分期標準，Ⅰ期52例，Ⅱ期26例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例，23例無記錄。有淋巴結轉移者37例，無淋巴結轉移者53例，23例無記錄。

1．2 方法

1．2．1 HE染色切片用于NSCLC組織學分類及分化程度、轉移狀態的判斷。

1．2．2 原位雜交所用地高辛標記MDR1、MRP寡核苷酸探針及檢測試劑盒購于武漢博士德生物公司，其操作按試劑盒說明書進行，以陽性片作陽性對照，PBS代替雜交液作陰性對照。

1．2．3 SP免疫組化染色按試劑盒說明操作，所用兔抗人survivin多克隆抗體、鼠抗人bcl2和bax單克隆抗體購于福州邁新生物公司，均為即用型。以已知陽性片作陽性對照。PBS代替一抗作陰性對照。

1．3 結果判斷 原位雜交染色中MDR1和MRPmRNA以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性細胞。免疫組化染色中survivin、bcl2和bax以胞漿呈棕黃色為陽性細胞。每例取10個高倍視野（×400），每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞所占百分比。陽性細胞數≥5%為陽性表達，＜5%為陰性表達。

1．4 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件分析數據，結果采用χ2檢驗。P＜0.05為顯著性檢驗水準。

2 結果

2．1 NSCLC中MDR1mRNA和MRP mRNA的表達及相互關系 113例NSCLC中，MDR1mRNA陽性表達率為51.3%（58/113），MRPmRNA陽性表達率為80.5%（91/113）。二者表達與腫瘤組織學類型、分化程度、TNM分期和有無淋巴結轉移等臨床病理因素均無明顯關系（P＞0.05），但二者表達之間具有顯著相關性（χ2＝13.72，P＜0.01），見表1。

2．2 3種凋亡相關蛋白的表達及相互關系

2．2．1 113例NSCLC中survivin、bcl2和bax蛋白的陽性表達率分別為79.6%（90/113）、59.3%（67/113）和54.9%（62/113）。

2．2．2 survivin和bax蛋白的表達與腫瘤細胞分化程度明顯相關（χ2＝6.74，P＜0.05；χ2＝16.39，P＜0.01）。survivin表達隨著腫瘤分化程度的降低而遞增，bax表達則呈相反趨勢。2種蛋白表達與腫瘤組織學類型、TNM分期和有無淋巴結轉移之間均無明顯相關（P＞0.05）。

表1 113例NSCLC中MDR1和MRP mRNA表達之間的關系 （略）

2．2．3 bcl2蛋白在不同組織學類型腫瘤中的表達順序依次為鱗癌＞腺鱗癌＞腺癌，差異具有統計學意義（χ2=13.06，P＜0.01）。但bcl2與腫瘤分化程度、TNM分期和有無淋巴結轉移之間差異均無顯著性（P＞0.05）。

2．2．4 survivin、bcl2和bax蛋白三者表達之間未見明顯相關（P＞0.05）。

2．3 多藥耐藥基因與凋亡相關蛋白表達間的關系

2．3．1 survivin蛋白與MDR1 mRNA的表達之間呈顯著正相關（χ2＝6.15，P＜0.05），survivin陽性表達率在MDR1 mRNA陽性組中較高，見表2，其表達與MRP mRNA表達間無相關性（P＞0.05）。

表2 113例NSCLC中survivin和MDR1mRNA表達之間的關系（略）

2．3．2 bcl2與MRP mRNA表達之間存在明顯正向關系（χ2＝4.64，P＜0.05），在bcl2呈陽性表達的病例中，MRP mRNA也多數呈陽性表達， 見表3，其表達與MDR1 mRNA表達間無相關性（P＞0.05）。

表3 113例NSCLC中bcl2和MRP mRNA表達之間的關系（略）

2．3．3 bax表達與多藥耐藥基因MDR1mRNA、MRPmRNA表達之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論 NSCLC原發性耐藥是治療中的棘手問題，其產生涉及多種復雜過程。MDR1和MRP編碼的膜糖蛋白介導的藥物外排泵是傳統的耐藥機制。細胞凋亡抑制參與多藥耐藥形成是近年來研究的熱點問題。許多抗腫瘤藥物是細胞凋亡的誘導劑，其效應可能主要是觸發了腫瘤細胞程序化死亡通路。凋亡有可能是大多數化療藥物作用的最終共同途徑，腫瘤細胞的耐藥可能是細胞凋亡的抑制。survivin是目前所知的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中最小的成員，也是迄今發現的最強的凋亡抑制因子之一。研究發現，survivin普遍表達于大多數腫瘤細胞，但在成人組織一般不表達或低表達。在有絲分裂中，survivin特異地結合caspase3和caspase7，直接抑制后兩者的活性，阻斷細胞的凋亡過程[1]。Olie等[2]用survivin的反義寡核苷酸導入肺腺癌A549細胞中，封閉survivin基因的表達，發現肺癌細胞對化療藥物誘導的細胞凋亡敏感性增加。Joseph等[3]報道，survivin能降低肺癌細胞對化療的敏感性。在胰腺癌[4]、白血病[5]和卵巢癌[6]等惡性腫瘤中也證實survivin的高表達與腫瘤細胞的耐藥有關。本組NSCLC中survivin的陽性率為79.6%，并與MDR1 mRNA的表達之間呈顯著正相關，提示survivin高表達可能是NSCLC患者對初次化療不敏感的原因之一。從分子水平分析，survivin基因位于染色體17q25，MDR1基因位于染色體7q21，兩基因位點并不一致，推測在腫瘤細胞內，二者之間可能存在轉錄活化的協同誘導機制，促使這兩個基因產物共同表達。 bcl2和bax屬于同一基因家族，在細胞凋亡通路上起正負調節作用，二者的比率被認為是調節凋亡易感性的重要因素。有研究發現bcl2蛋白過表達參與NSCLC中MDR形成?？赡苡捎谀[瘤細胞中bcl2蛋白表達量增加，導致凋亡阻斷作用過強，因此抑制了藥物誘導的細胞凋亡，同時也降低了細胞對化療藥物的敏感性[7]。本組NSCLC中bcl2蛋白表達率為59.3%，且其表達與MRP mRNA表達呈正向關系，顯示bcl2可能是通過介導MRP mRNA的高表達，成為參與NSCLC原發耐藥的重要因素之一，二者之間具體的調節機制仍有待于深入研究。bax通過抑制bcl2而致細胞凋亡，其是否與肺癌耐藥有關仍有不同看法。本研究中bax與MDR1 mRNA、MRP mRNA表達無關，推測bax可能不是影響NSCLC原發耐藥的因素。本文結果還提示，MDR1mRNA和MRPmRNA在不同組織學類型、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移狀態的NSCLC中的表達差異無顯著性，但survivin和bax的表達與腫瘤分化程度有關，bcl2與組織學類型有關，檢測它們的表達，對判斷腫瘤的發展及其轉歸有一定的價值。 NSCLC原發性多藥耐藥的形成機制是一個復雜的體系。本研究結果顯示，凋亡抑制蛋白survivin的高表達和bcl2的過表達可能是導致NSCLC原發耐藥的重要因素，檢測survivin和bcl2的陽性率對臨床逆轉 NSCLC多藥耐藥性具有一定指導意義。

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