作者：姬明麗，千智斌，宋曉榮

【摘要】 目的 探討NSCLC的化療耐藥性和參與介導多藥耐藥的相關基因和蛋白LRP及GSTπ的表達，對比分析NSCLC的多藥耐藥性與上述二種耐藥相關基因表達的關系。方法 應用腫瘤細胞體外培養和MTT法對91例未經化療的NSCLC進行體外化療藥物敏感性測試，觀察NSCLC分別對環磷酰胺、阿霉素、順鉑+5Fu三種單藥和聯合用藥方案耐藥情況和總的耐藥情況，并用免疫組織化學方法對其進行3種耐藥相關基因（LRP、MRP及GSTπ）表達的檢測，并將其表達情況與對應的化療耐藥性進行相關分析。結果 91例NSCLC化療敏感性檢測結果顯示：53例（58.2%）對環磷酰胺耐藥，51例（56.0%）對阿霉素耐藥，42例（46.2%）對順鉑+5Fu耐藥。其中，19例（20.9%）對三種用藥均敏感，27例（29.8%）對三種用藥均耐藥，其耐藥性與組織學類型和分化程度無關（P＞0.05）。LRP和GSTπ在91例NSCLC中總的陽性表達率分別為：53.8％和64.8%。鱗癌和腺癌相比LRP和GSTπ的表達無顯著性差異（P＞0.05）。且LRP和GSTπ的表達與對三種化療用藥的耐藥性均呈顯著正相關 (P<0.05)，并且不同表達程度間也有顯著差異性 (P＜0.05)。結論 LRP和GSTπ在NSCLC中均有較高的陽性表達并共同介導參與了NSCLC固有多藥耐藥機制。

【關鍵詞】 NSCLC；多藥耐藥； LRP基因；谷光甘肽轉移酶π基因；體外藥敏試驗；免疫組織化學

The Effection of LRP and GSTπ in Mechanism of Drug Resistance of Nonsmall Cell Lung Cancer

Key words：Nonsmall lung cancer;Multidrug resistance;Lung resistancerelated protein gene;Glutathione stransferasesπ;In vitro chemosensitivity assay;Immunohistochemisty

化療是對失去手術機會及術后復發的非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者治療的一個重要手段，但由于多藥耐藥的（multidrug resistance，MDR）產生常導致化療失敗。本實驗應用腫瘤細胞體外培養、MTT法和免疫組織化學對91例NSCLC的化療耐藥性與肺耐藥蛋白（lung resistancerelated protein，LRP）及谷光甘肽轉移酶π(glutathione stransferasesπ，GSTπ)的表達關系進行研究，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1材料收集2001年9月～2002年10月間新鄉醫學院第一附屬醫院、新鄉醫學院第三附屬醫院胸外科手術切除的NSCLC新鮮標本91例。所有患者術前均未接受過化、放療。每例標本分為兩份，一部分立即消化后用于藥敏試驗；另一部分常規10%福爾馬林固定、石蠟包埋、連續5μm切片，用于免疫組化染色檢查相關耐藥基因的表達情況。

1.1.2主要試劑及培養基小牛血清、RPMI1640、膠原酶Ⅰ型為Gibco/BRL公司產品；二甲基亞砜、噻唑藍為Sigma公司產品。

1.1.3化療藥物及配制

(1) 化療藥物環磷酰胺（Cyclophamide）、阿霉素（Adriamycin）為北京協和制藥廠產品；順鉑（Cisplatin）、5Fu為旭東海普藥業有限公司產品。

(2) 藥物濃度及配制均采用藥物在人體內的血漿高峰濃度為藥敏測試的藥物濃度。

1.1.4免疫組織化學試劑鼠抗人LRP單克隆抗體（LRP56）、鼠抗人GSTπ單克隆抗體（A3600）、PV6000通用型二步法免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒及免疫組織化學染色常用試劑，均購于北京中山生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1藥敏實驗（MTT法）參照文獻[1]進行。藥物敏感性判斷標準[2]：腫瘤細胞生長抑制率≤30%為耐藥，31%～50%為低度敏感，51%～70%為中度敏感，70%為高度敏感。

1.2.2免疫組織化學染色及判斷標準染色方法 按PV6000通用型二步法免疫組化試劑盒說明書進行。結果判斷，參照文獻[3] 進行。

1.3統計學處理采用卡方檢驗、KruskaiWallis Test和Spearman Test，均借助SPSS10.0軟件完成。

2結果

2.1NSCLC的化療耐藥性

2.1.1總體耐藥情況53例（58.2%）對環磷酰胺耐藥，51例（56.0%）對阿霉素耐藥，42例（46.2%）對順鉑+5Fu耐藥。其中，19例（20.9%）對3種用藥均敏感，27例（29.8%）對3種用藥均耐藥，見表1。表191例NSCLC（鱗癌50例，腺癌41例）對三種用藥方式的耐藥情況

2.1.2組織學類型與化療耐藥性的關系不同組織學類型（鱗癌和腺癌）的NSCLC的化療耐藥性無差異（P＞0.05），見表2。表2NSCLC組織學類型和分化程度與耐藥的關系＊鱗癌與腺癌相比；＊＊高分化與中分化相比；＊＊＊低分化與高分化和中分化相比。2.1.3分化程度與化療耐藥性的關系 比較分化程度與化療耐藥性的結果顯示：鱗癌：高分化與中分化間無差異（P＞0.05），但二者與低分化相比，低分化鱗癌對所用化療藥物和藥物聯合明顯敏感（P＜0.05）。腺癌：高、中、低分化間均無差異（P＞0.05），但3例低分化腺癌對所用化療藥物和藥物聯合均敏感，見表2。

2.2耐藥相關基因表達與NSCLC耐藥性的關系

2.2.1LRP在NSCLC的表達與化療耐藥性的關系

（1）LRP在NSCLC的表達及與化療耐藥性的關系 LRP陽性部位定位于細胞漿，呈棕黃色，見圖1、2。91例NSCLC中LRP陰性者42例（包括鱗癌和腺癌，46.2%），陽性者49例（包括鱗癌和腺癌，53.8%）。鱗癌和腺癌相比LRP的表達無顯著性差異（P＞0.05），見表3。表3LRP 、GSTπ在NSCLC中的表達

組織學類型LRP表達GSTπ表達-+++-+++鱗癌261212171815 腺癌16817151115

（2）NSCLC中LRP的表達與耐藥性的關系LRP的表達在NSCLC的組織學類型（鱗癌和腺癌）間無顯著性差異，故對其表達與NSCLC耐藥性的關系也未進行組織學類型的分解，結果顯示：對于三種化療用藥方案，LRP的表達與NSCLC的耐藥性均呈顯著的正相關（P＜0.05）；其不同表達程度間也有差異性顯著（P＜0.05），見表4。表4LRP、GSTπ的表達與NSCLC化療耐藥性的關系

方案LRP表達GSTπ表達-+++-+++環磷酰胺耐藥8162971630敏感344025130阿霉素 耐藥8152861629敏感345126131順鉑+5Fu耐藥0142801428敏感426132152

2.2.2GSTπ在NSCLC的表達及與化療耐藥性的關系

（1）GSTπ在NSCLC中的表達GSTπ陽性部位定位于細胞漿，呈棕黃色，見圖3、4。91例NSCLC中GSTπ陰性者32例（包括鱗癌和腺癌，35.2%），陽性者59例（包括鱗癌和腺癌，64.8%）。鱗癌和腺癌相比GSTπ的表達無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

（2）NSCLC中GSTπ的表達與耐藥性的關系 GSTπ的表達在NSCLC的組織學類型（鱗癌和腺癌）間無顯著性差異，故對其表達與NSCLC耐藥性的關系未進行組織學類型的分解，結果顯示：對于三種化療用藥方案，GSTπ的表達與NSCLC的耐藥性均呈顯著正相關（P＜0.05）；其不同表達程度間也有顯著性差異（P＜0.05），見表4。

3討論

本研究對91例NSCLC化療敏感性檢測結果顯示：53例（58.2%）對環磷酰胺耐藥，51例（56.0%）對阿霉素耐藥，42例（46.2%）對順鉑+5Fu耐藥。其中，19例（20.9%）對三種用藥均敏感，更有27例（29.8%）對三種用藥均耐藥，說明部分NSCLC有著固有的化療耐藥性。目前NSCLC誘導化療的總緩解率一般在70%左右[4]，與本研究結果相符。本研究結果還顯示：不同組織學類型（鱗癌和腺癌）的NSCLC化療耐藥性無差異（P＞0.05）；比較分化程度與化療耐藥性的結果顯示：鱗癌：高分化與中分化間無差異（P＞0.05），但二者與低分化相比，低分化鱗癌對所用化療藥物和藥物聯合明顯敏感（P＜0.05）。腺癌：高、中、低分化間均無差異（P＞0.05），但所有3例低分化腺癌對所用化療藥物和藥物聯合均敏感，說明低分化者對所用化療藥物和藥物聯合有較好的敏感性。有研究［5］表明腫瘤在未接觸化療藥物前已存在有MDR基因的表達，從本實驗的結果來看，有46.2%～58.2%的NSCLC在化療前已存在著對多種化療藥的耐藥性，與此相符。

作為構成人體穹隆蛋白（major vault protein ，MVP）的主要成分，LRP廣泛分布在人體體腔上皮、分泌器官等正常組織中，與Ppg、MRP一樣，LRP的主要作用是清除外源性毒性物質，使機體免受損害，其作用機制——阻止以細胞核為靶點的藥物通過核孔進入細胞核，并將藥物轉運到細胞漿的囊泡中，以胞吐的方式排到細胞外[5]。有研究證實LRP參與多種腫瘤對多種化療藥物的耐藥[6]，但LRP在NSCLC的表達和與耐藥關系的研究較少。本研究發現LRP在NSCLC中陽性表達為53.8%，表明LRP在NSCLC中有著較高而強的陽性表達，提示LRP在NSCLC的固有化療耐藥機制中起著一定的作用。本研究發現91例NSCLC中LRP的表達與對環磷酰胺、順鉑+5Fu、阿霉素的耐藥性均呈顯著正相關，并隨表達程度的增加而增加（P<0.05），說明在NSCLC中LRP參與了阻止順鉑和5Fu等對腫瘤細胞DNA的破壞，并且通過胞吐作用對阿霉素影響轉錄的作用予以限制。故化療前對NSCLC的LRP表達的檢測，對于預測NSCLC對上述藥物的耐藥有著積極的指導意義。

GSTs是一多基因家族，目前已發現有α、μ、π、θ和膜結合型5種同工酶，不僅可做為腫瘤轉化的標志，而且能催化谷胱甘肽（GSH）與親電性物質如抗癌藥物結合，通過的活性將抗癌藥物排出細胞，是腫瘤細胞對抗癌藥物的代謝和運輸能力增強，從而使腫瘤產生耐藥性，而且很多對常規化療藥物耐藥的細胞株的GSTs活性較高，GSTπ是GST的幾種同工酶中表達最高的一種[5]。本研究發現GSTπ在

NSCLC的陽性表達率為64.8%，也證明GST在NSCLC中有著高而強的陽性表達，提示GSTπ可能是介導NSCLC固有耐藥性的主要原因之一。有關NSCLC中GSTπ表達與以順鉑為主的誘導化療療效分析的研究表明，GSTπ高表達患者的生存期明顯低于低表達者，且GSTπ高表達與p53突變顯著相關，說明GSTπ通過外排順鉑抑制了由順鉑導致的p53依賴的腫瘤細胞的凋亡。本研究結果也顯示GSTл的表達與NSCLC對環磷酰胺、順鉑+5Fu及阿霉素的化療耐藥性呈顯著的正相關并與表達程度有關（P<0.05），說明GSTπ是介導NSCLC固有耐藥性的重要耐藥性因素之一。

通過本研究，我們發現非小細胞肺癌存在著固有的化療耐藥性，而且LRP及GSTЛ的表達與NSCLC的耐藥性呈明顯的相關性并與表達程度正相關，說明LRP及GSTЛ基因共同參與作用了NSCLC的固有的化療耐藥性。