作者：李梅，趙寶霞，于志紅，劉敏，范凱，呂申

【摘要】 目的 探討胃腸道癌組織錯配修復蛋白表達與其對化療藥物耐藥性產生的關系。方法 免疫組織（細胞）化學方法檢測5例胃癌、18例大腸癌及相應癌旁組織和胃癌細胞株BGC823及其耐藥株BGC823/cDDP錯配修復蛋白表達情況；MTT法檢測癌組織及上述2種細胞株對順鉑、5Fu、長春新堿、絲裂霉素的耐受性。結果 癌組織hMSH2蛋白陽性表達率（74%）與癌旁組織（59%）無顯著差別，且在兩組表達有顯著相關性；癌組織hMLH1蛋白陽性表達率（57%）顯著高于癌旁組織（23%）。對5Fu高度耐藥的癌組織錯配修復蛋白表達率顯著低于中度耐藥和不耐藥組；癌組織對其他藥物耐受程度與錯配修復蛋白表達間未見顯著相關關系。耐藥株hMSH2蛋白表達強度明顯弱于親本株（BGC823），hMLH1蛋白表達強度在2種細胞株無明顯差異。耐藥株較親本株對cDDP、5Fu和VCR耐藥性均有增加，耐藥指數分別為3.93、1.87和2.03。結論 錯配修復系統功能狀態可能與個體遺傳背景有關；其蛋白表達下調參與胃腸道癌對5Fu的原發耐藥機制和胃腸道癌細胞多藥耐藥性的產生。

【關鍵詞】 錯配修復蛋白；原發耐藥性；胃腸道癌

The Relationship of Mismatch Repair Proteins Expression to Drug Resistance of Gastrointestinal Tract

Key words：Mismatch repair protein; Intrinsic drug resistance; Gastrointestinal carcinoma

錯配修復蛋白是20世紀90年代初發現的，在保證DNA復制準確性和維護基因組穩定性中起關鍵作用，其異常表達與胃腸道癌的發生、發展密切相關［1］。近年來，一些學者認為錯配修復蛋白表達異常還與腫瘤細胞耐藥性的產生有關，但其機制仍不清楚。本實驗通過研究胃腸道癌組織及胃癌細胞株錯配修復蛋白hMSH2和hMLH1的表達與其對常用化療藥物敏感程度的關系，探討胃腸道癌對化療藥物耐藥性產生的機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

取自2000～2003年在大連醫科大學附屬二院接受手術治療患者的腫瘤標本23例，其中胃癌5例，大腸癌18例。患者男14例，女9例，平均年齡（58.6±13.2）歲，術前均未接受過放射和化學藥物治療。取手術切除的癌及癌旁組織標本。將癌組織分為兩部分，一部分（癌組）同癌旁組織（癌旁組），經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，連續切片，用于HE染色的組織病理學診斷和免疫組織化學染色的蛋白表達檢測；另一部分在離體2h內用于體外藥物耐受性檢測（MTT法）。

人低分化胃腺癌細胞株BGC823購自上海細胞生物所，由本實驗室保存；順鉑耐藥株BGC823/cDDP采用逐步遞增順鉑濃度、間歇作用體外誘導法獲得，由本室構建。

1.2 試劑和方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測癌組織錯配修復蛋白表達

鼠抗人hMSH2單克隆抗體購自美國CALBIOCHEM公司（工作濃度1∶50）；鼠抗人hMLH1單克隆抗體購自美國PHARMINGEN公司（工作濃度1∶50），SP試劑盒及DAB顯色系統購自福州邁新生物技術開發有限公司。免疫組化染色流程按試劑盒說明書進行。以已知染色陽性切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。結果判斷：以細胞核內出現棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，計數5個高倍視野，陽性細胞數與腫瘤細胞總數之比≥10%，判為表達陽性，否則為陰性。同一病例hMSH2和hMLH1均為陽性表達或其中任意一種蛋白為陽性表達判為錯配修復蛋白陽性表達，否則為陰性表達。

1.2.2 MTT法檢測癌組織對常用化療藥物的耐受性

檢測胃腸道癌細胞對順鉑（cDDP）、5Fu、長春新堿（VCR）、絲裂霉素（MMC）等4種作用機制不同化療藥物的耐受性。所選藥物終濃度為常規臨床用藥時患者血漿高峰濃度的10倍。取腫瘤組織2～3mm3，制成單細胞懸液，調整最終細胞濃度為3×105個/ml，接種于96孔板。設實驗組（腫瘤細胞懸液100μl/孔，化療藥物10μl/孔，培養液90μl/孔）、對照組（腫瘤細胞懸液100μl/孔，培養液100μl/孔）和空白組（培養液200μl/孔），每組復孔3個。加藥后充分混勻，置于培養箱在5%CO2，37℃條件下培養48h，加入MTT試劑（20μl/孔），繼續培養4h，再加入DMSO（100μl/孔），充分溶解，用酶標儀（λ=570nm）測定每孔吸光度（A值）。根據公式計算抑制率，抑制率=（1－A實驗組/A對照組）×100%。藥物耐受性判定標準如下，高度耐藥：抑制率＜30%；中度耐藥：抑制率≥30%，但＜50%；不耐藥：抑制率≥50%。

1.2.3 免疫細胞化學方法檢測兩種細胞株錯配修復蛋白表達

取對數生長期BGC823和BGC823/cDDP細胞，PBS洗2次，取少量細胞涂片，丙酮4℃固定30min，室溫風干。常規免疫細胞化學SP法染色，無需抗原修復，其他操作步驟同1.2.1。

1.2.4 MTT法檢測兩種細胞株對cDDP、5Fu、VCR的耐藥性

取對數生長期的培養細胞BGC823及BGC823/cDDP，調整細胞濃度至3×105個/ml。實驗組分別加入不同倍比稀釋濃度梯度的cDDP、5Fu、VCR抗癌藥10μl/孔，其他操作方法及步驟同1.2.2。通過半數抑制濃度（IC50）計算BGC823/cDDP對5Fu的耐藥指數，耐藥指數=IC50（BGC823）/IC50（BGC823/cDDP）。

1.2.5 統計學分析

采用四格表χ2檢驗及秩和檢驗法，在SPSS10.0統計軟件上計算分析。

2 結果

2.1 癌及癌旁組織錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1的表達

癌組織hMSH2蛋白的陽性表達率74%（17/23）與癌旁組織陽性表達率59%（13/22）無顯著差別（P＞0.05），兩組表達有顯著相關性（P＜0.05），見表1；癌組織hMLH1蛋白的陽性表達率57%（13/23）顯著高于癌旁組織陽性表達率23%（5/22）（P＜0.05）。表1 錯配修復蛋白hMSH2在癌組織注：χ2=11.917，P=0.0012.2 癌組織對化療藥物耐受性與錯配修復蛋白表達的關系

2.3 兩種細胞株錯配修復蛋白的表達及耐藥性變化

錯配修復蛋白hMSH2、hMLH1在細胞株BGC823/cDDP和BGC823均有表達，hMSH2蛋白在細胞株BGC823/cDDP表達強度明顯弱于細胞株BGC823，hMLH1蛋白表達強度在2種細胞株無明顯差異。

細胞株BGC823/cDDP對cDDP、5Fu和VCR耐藥指數分別為3.93、1.87和2.03，其耐藥性較BGC823均有增加。

3 討論

錯配修復系統由一系列能特異性識別、結合錯配堿基和完成剪切修復的酶分子組成。hMSH2是組成異源二聚體hMutS α或hMutS β的核心蛋白，參與識別錯配堿基和插入缺失環；hMLH1是組成異源二聚體hMutL α或hMutL β的核心蛋白，參與切除錯配堿基和插入缺失環。它們共同參與完成錯配修復反應，以保證基因組復制穩定性［2，3］。許多研究表明這兩種蛋白編碼基因的突變和異常表達常在胃癌、大腸癌細胞中出現。錯配修復基因功能缺失已被視為遺傳非息肉性結腸癌（Hereditary Non Polyposis Colon Cancer，HNPCC）的重要發病原因［4］。本研究檢測了hMSH2和hMLH1蛋白在5例胃癌、18例大腸癌的癌組織及相應癌旁組織的表達發現，hMSH2的陽性表達率在癌與癌旁組織卻無顯著差異，且該蛋白在癌與癌旁組織常同步表達，表明hMSH2蛋白表達程度可能與個體遺傳背景有關，也提示錯配修復系統功能狀態的不同可能由個體遺傳特點決定；然而癌組織hMLH1的陽性表達率顯著高于癌旁組織，究其原因可能是癌細胞存在較多需要切除的錯配堿基。

一些學者認為腫瘤細胞錯配修復功能的喪失與其對烷化劑、鉑類等耐藥性產生有關［5，6］，但研究的多是與腫瘤細胞繼發耐藥性產生的關系。本研究選取的病例均未接受過術前放射和化學治療，MTT法檢測的耐藥性為原發耐藥性。因hMSH2和hMLH1任意一種蛋白表達缺失都會導致錯配修復功能缺失，故本實驗將任意一種蛋白表達缺失記為錯配修復功能缺失。我們發現：胃腸道癌組織對5Fu的耐受程度與錯配修復蛋白表達密切相關，其表達率在高度耐藥組顯著低于中度耐藥組和不耐藥組；癌組織對其他藥物耐受程度與錯配修復蛋白表達未見顯著相關關系。提示胃腸道癌組織對5Fu的原發耐藥性可能與錯配修復蛋白表達降低有關。而5Fu是胃腸道癌常用的化療藥物之一，這一結果可能為臨床化療藥物的選用提供幫助。

順鉑誘導構建的耐藥株BGC823/cDDP不但對cDDP耐藥，同時還出現了對5Fu和VCR的耐藥，即多藥耐藥。此時耐藥細胞錯配修復蛋白hMSH2表達較親本細胞株BGC823明顯降低。提示錯配修復蛋白表達降低可能與胃腸道癌細胞多藥耐藥性的產生有關。

總之，錯配修復蛋白的表達狀態是個體遺傳背景的反映，其表達降低可能是胃腸道癌細胞對化療藥物產生耐受的原因，通過對錯配修復蛋白表達的檢測對臨床抗癌藥物的選用將會有一定的指導意義。

【參考文獻】 ［1］ Schofield MJ， Hsieh P. DNA mismatch repair: molecular mechanisms and biological function［J］. Annu Rev Microbiol， 2003， 57: 579608. ［2］Genschel J， Bazemore LR， Modrich P. Human exonuclease I is required for 50 and 30 mismatch repair［J］. J Biol Chem， 2002， 277(15)：1330213311. ［3］Raschle M， Marra G， NystromLahti M， et al. Identification of hMutLbeta， a heterodimer of hMLH1 and hPMS1［J］. J Biol Chem， 1999， 274(45)：3236832375. ［4］Bignami M， Casorelli I， Karran P. Mismatch repair and response to DNAdamaging antitumour therapies［J］. Eur J cancer， 2003， 39(15): 21422149. ［5］Fedier A， Fink D. Mutations in DNA mismatch repair genes: implications for DNA damage signaling and drug sensitivity［J］. Int J Oncol， 2004， 24(4): 10391047. ［6］Aebi S， KurdiHaidar B， Gordon R， et al. Loss of DNA mismatch repair in acquired resistance to cisplatin［J］. Cancer Res， 1996， 56(13): 30873090.