作者：李紅霞，關(guān)新元，張素梅，尹冬梅

【摘要】 目的 研究染色體特定區(qū)域DNA拷貝改變、基因差異表達及其與紫杉醇耐藥的關(guān)系。方法 運用比較基因組雜交（comparative genomic hybridization，CGH）及RTPCR技術(shù)，分析卵巢癌紫杉醇耐藥株染色體基因組變化和hmsh2基因在卵巢癌組織中的表達。結(jié)果 CGH結(jié)果顯示最有意義的變化是卵巢癌紫杉醇耐藥株OC3/Tax300細胞染色體2p22過度擴增。RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)hmsh2基因在OC3/Tax300細胞高度表達。hmsh2基因表達陽性率在組1和組2分別為93.9%（31/33）及47.6%（10/21），差異有顯著性;在低分化癌為93.3%，顯著高于中、高分化癌的54.2%。結(jié)論 2p22拷貝數(shù)的過度擴增及hmsh2基因的高度表達可能與卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 卵巢癌；紫杉醇耐藥細胞系；比較基因組雜交；hmsh2基因

基金項目：首都醫(yī)學發(fā)展科研基金(重點學科)資助項目（ZD199915）

Study on the Relationship of Taxolresistance of Ovarian Carcinoma with the Amplification of 2p22 on Chromosome and the Expression of hmsh2 Gene.

Key words：Ovarian carcinoma;Taxolresistant cell lines;CGH; hmsh2 gene

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。目前，在其治療方面，紫杉醇以其確切的療效已成為應(yīng)用最廣泛的化療藥物之一，且與順鉑、阿霉素之間無交叉耐藥，已成為治療卵巢癌的一線藥物。但隨之而來的耐藥問題成為臨床治療的障礙，嚴重制約了卵巢癌病人的療效。解決這一難題的關(guān)鍵在于揭示其耐藥機制，為進一步進行臨床逆轉(zhuǎn)耐藥及預防耐藥的研究提供基礎(chǔ)，最終達到預防和逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生，改善卵巢癌的治療效果，提高患者的生存率。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與細胞培養(yǎng) 紫杉醇耐藥細胞株親代細胞OC3由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院分子生物學實驗室李春海教授惠贈，本室傳代培養(yǎng)保存；兩種紫杉醇耐藥細胞株：OC3/Tax300 及OC3/Tax50由本室以不同劑量的紫杉醇誘導建立[1]。細胞生長于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；用0.25%胰酶消化傳代，12h細胞即可貼壁，約24h后進入指數(shù)生長期，每2～3天傳代一次。

1.1.2臨床標本 選擇2000年3月～2005年5月間北京世紀壇醫(yī)院婦科實驗室所收集的卵巢癌標本54份（均冷凍保存于液氮中），其中分為2組：術(shù)前使用紫杉醇先期化療者、或因復發(fā)而行二次手術(shù)者共33份（組1）;術(shù)前未經(jīng)任何藥物化療者21份（組2）。標本的組織學類型：漿液性卵巢癌26份，粘液性卵巢癌21份，子宮內(nèi)膜樣癌7份；組織學分級：低分化癌30份，中、高分化癌24份。

1.2方法

1.2.1比較基因組雜交

常規(guī)酚－氯仿法提取耐藥株、敏感株的DNA和健康女性外周血基因組DNA。制備健康女性淋巴細胞中期染色體。以切口平移法，用熒光素－dUTP （綠色熒光）標記敏感株和耐藥株DNA，羅丹明－dUTP （紅色熒光）標記配對的正常外周血DNA。染色體玻片預處理后，分別與標記的待測DNA探針和參照DNA探針雜交。熒光顯微鏡下觀察染色體上不同的熒光，熒光圖像分析系統(tǒng)攝取并比較紅綠兩種熒光的強度，得出兩組DNA的熒光比率和分析圖。

1.2.2RTPCR擴增

參照文獻[2]設(shè)計hmsh2引物序列，由上海生工生物有限公司合成。上游：5’ caa ttg aaa gga gtc tcc acg 3’ (21bp) 下游: 5’ aaa ctc ctc aag ttc cag gg 3’ (20bp)，擴增片段長度為411bp。細胞及組織RNA提取參照TRIzol Reagent （life technologies）試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系：10×緩沖液2μl，10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）1.5μl，25mmol/L MgCL2 2.4μl，上、下游引物各2μl，cDNA 1μl，Taq酶0.1μl，加去離子水9μl至終體積20μl。反應(yīng)條件為：94℃ 5min預變性；然后95℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3統(tǒng)計學分析

χ2檢驗及Fisher精確檢驗。

2結(jié)果

CGH結(jié)果顯示紫杉醇敏感株細胞和兩種耐藥株細胞的遺傳物質(zhì)均有不同程度的改變，涉及10條染色體，見表1。遺傳物質(zhì)表達丟失的有：1，3p，4，6，7q，8p號染色體；表達增加的有：2p22，3q，5p，9，10號染色體。僅在敏感株OC3中表達增強的是10號染色體；表達缺失的是7q，8p。3p缺失發(fā)生在OC3和耐藥株OC3/Tax300。敏感株和耐藥株OC3/Tax50的10q22表現(xiàn)為高度擴增。2p22僅在耐藥株OC3/Tax300中為高度擴增，見圖1。

3討論

體外培養(yǎng)的細胞系以其清晰的遺傳背景，豐富的來源，成為研究某些類型癌基因及其功能改變的必要工具，并且這些細胞系具備與原發(fā)腫瘤相同的遺傳學特點和分子生物學性狀[3]。本研究所用的兩種紫杉醇耐藥細胞系OC3/Tax300、OC3/Tax50是參照臨床化療的劑量和給藥方式設(shè)計誘導而建成。OC3/Tax300細胞株耐藥性穩(wěn)定，耐藥指數(shù)為6.70，對拓樸替康有明顯的交叉耐藥。之前曾有學者分別用長春新堿、紫杉醇及阿霉素對親代細胞進行體外誘導建立耐藥細胞系，并利用CGH、FISH等技術(shù)將親代細胞和子代細胞的染色體變化進行檢測，發(fā)現(xiàn)一些染色體的異常變化與耐藥有關(guān)。如 6q2125拷貝數(shù)的增加，7q2136和 10q1215拷貝數(shù)的減少參與鉑類耐藥；7q11.221的拷貝數(shù)增加與紫杉醇耐藥相關(guān)[46]。CGH是一種全方位檢測法，一次雜交試驗即可在整個基因組水平對不同基因組間DNA序列拷貝數(shù)差異進行檢測并定位。利用這項技術(shù)可以對不同類型的腫瘤、同一腫瘤的不同發(fā)展階段的遺傳物質(zhì)的改變進行檢測。本研究發(fā)現(xiàn)三種細胞株均存在遺傳物質(zhì)的不平衡變化。通過對比分析發(fā)現(xiàn)耐藥細胞OC3/Tax300的2p22呈現(xiàn)特異性高水平擴增。

染色體2p22上存在腫瘤耐藥相關(guān)基因，如錯配修復（MMR）家族中的hmsh2基因[7，8]。正常情況下，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是靠AT，CG間的氫鍵互補配對來維持，如果因各種原因使得DNA之間的堿基互補配對發(fā)生錯誤形成了DNA錯配時，機體會對錯配了的堿基進行修復以保證DNA復制的忠實性和維持基因組的穩(wěn)定性。具備這種作用的基因就是錯配修復基因。進一步RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)hmsh2基因在OC3/Tax300細胞高度表達，在OC3/Tax50細胞呈弱表達，而在OC3細胞未見表達；在臨床紫杉醇化療后標本中hmsh2基因表達率顯著高于未經(jīng)化療組，均表明該基因的過度表達與紫杉醇耐藥有關(guān)。推測其機制可能是：化療藥物導致腫瘤細胞的DNA損傷，此時由某種途徑激活hmsh2基因，使其修復作用增強，不斷地修復由藥物造成的堿基錯配、片段插入/缺失，以保證DNA復制的忠實性來對抗藥物對細胞的損傷殺滅作用。hmsh2基因在卵巢癌不同的組織學類型之間的表達差異，則表明低分化癌之所以預后較差，其原因之一可能是該類腫瘤易發(fā)生化療耐藥。

盡管hmsh2的異常表達可能與卵巢癌的紫杉醇化療具有相關(guān)性，但2p22上除了hmsh2基因與耐藥相關(guān)外，尚存在許多候選基因，如：黃嘌呤脫氫酶基因（XDH），鈣調(diào)節(jié)蛋白2基因（CALM2）可能也和耐藥有關(guān)，因此hmsh2基因與紫杉醇耐藥之間的關(guān)系及其確切機制有待進一步研究。