作者：符淳，李光儀， 劉曉英 ，林秋華， 劉風(fēng)英， 謝詠

【摘要】 目的 探討不同濃度順鉑作用不同時間誘導(dǎo)敏感和耐藥卵巢癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡變化規(guī)律和凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達。方法 選擇卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系 A2780/DDP和敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780為研究對象。在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上，運用MTT比色法、原位標(biāo)記法、常規(guī)免疫組化和蛋白印跡等方法，觀察不同劑量的順鉑（5、10、20、40μmol/L）和作用不同時間（24、48、72h）對A2780和A2780/DDP細(xì)胞凋亡的影響和此動態(tài)變化過程中半胱天冬氨酸蛋白酶2（Caspase2）和3（Caspase3）表達。結(jié)果 順鉑對A2780和A2780/DDP細(xì)胞系凋亡的誘導(dǎo)呈時間和劑量依從性。細(xì)胞凋亡蛋白Caspase2和Caspase3的活化促進順鉑誘導(dǎo)的凋亡，其表達呈現(xiàn)出對順鉑作用時間和劑量的依從性。結(jié)論 （1）在順鉑耐藥機理中，藥物在體內(nèi)分布和代謝，對血藥有效濃度的影響和細(xì)胞對藥物排斥引起順鉑進入細(xì)胞存在一定的阻礙可能是降低順鉑敏感性的因素。（2）Caspase2和caspase3蛋白活化延后和活性降低可能是影響耐藥A2780/DDP細(xì)胞凋亡的原因。

【關(guān)鍵詞】 順鉑耐藥;凋亡;Caspase2;Caspase3;人卵巢癌

CisplatinInduced Apoptosis in Cisplatinresistant Ovarian Cancer Cell Line A2780/DDP on Time and Dose Dependence

Key words：Cisplatinresistance;Apoptosis;Caspase2;Caspase3;Human ovarian caner

卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥是降低患者5年生存率的關(guān)鍵問題。耐藥的卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)為自發(fā)凋亡能力明顯下降和癌細(xì)胞無限制惡性增殖生長 [1]。順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡過程中最顯著的變化是細(xì)胞內(nèi)經(jīng)線粒體凋亡途徑激活[2]。從時間和劑量角度把握順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和耐藥細(xì)胞A2780/DDP發(fā)生凋亡的變化規(guī)律，了解在凋亡上游途徑起傳導(dǎo)信號作用的Caspase2蛋白和下游起執(zhí)行作用的Caspase3蛋白表達變化方式，將有助于進一步理解卵巢癌順鉑耐藥機制。

1材料與方法

1.1人卵巢癌細(xì)胞系

A2780和A2780/DDP均購自同濟醫(yī)院腫瘤中心，A2780/DDP細(xì)胞系對順鉑的耐藥是A2780細(xì)胞系的9.4倍[3]。用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑

順鉑（批號H37021358）：山東齊魯制藥廠產(chǎn)品，分子量為300.3。考馬斯亮蘭蛋白質(zhì)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Caspase2（BA0587，200μg/ml）、Caspase3（BA0588，200μg/ml）和actin（200μg/ml）兔多克隆抗體、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（MK1020），即用型SABC免疫組化染色試劑盒（SA1022）、蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）檢測試劑盒（SA2022）、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.3主要方法

1.3.1順鉑對卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP生長抑制效果 MTT法測定，順鉑終濃度分別為0、2、5、10、20、40、80、200μmol/L（μM），分別培養(yǎng)24、48、72h；計算不同濃度順鉑對細(xì)胞生長抑制率：抑制率=（對照組A均值－實驗組A均值）/對照組A均值。

1.3.2順鉑對卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和A2780/DDP凋亡誘導(dǎo) 根據(jù)1.3.1結(jié)果，選擇5種順鉑濃度（0、5、10、20、40μmol/L）分別誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24、48、72h后終止實驗作成細(xì)胞爬片或收集細(xì)胞，實驗1.3.3～1.3.5均按此方法進行。

1.3.3末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）原位標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡和判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)試劑盒步驟檢測。陽性及半定量判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細(xì)胞。陽性半定量方法為：每例（400×鏡下）選取9個視野，即玻片左、中、右3區(qū)各取前、中、后3個視野，計算各視野內(nèi)卵巢癌細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，計算其陽性細(xì)胞的百分比例。

1.3.4Caspase2蛋白在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP凋亡中表達 提取卵巢癌細(xì)胞蛋白質(zhì)；測定蛋白質(zhì)濃度；蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；將蛋白樣本轉(zhuǎn)膜；按試劑盒所示行蛋白質(zhì)印跡法檢測。其中一抗效價為1∶400～1∶500，選對照為actin（50μg）。

1.3.5順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP凋亡中Caspase3蛋白檢測和判斷標(biāo)準(zhǔn)：按免疫組化SABC方法進行，加入一抗效價為1∶100。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核或胞漿呈棕黃色至深棕色者為陽性細(xì)胞。陽性半定量方法同1.3.3所示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，對計量資料進行方差齊性檢驗。方差齊性者，用單因素方差分析(oneway ANOVA)檢驗總體均數(shù)差異性，有顯著性差異者再進行兩兩比較(StudentNewmanKeuls Test)。P＜0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1順鉑對卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP生長抑制

順鉑對A2780細(xì)胞系生長抑制呈明顯劑量時間依賴關(guān)系：順鉑作用48h后，明顯抑制A2780細(xì)胞生長，其中20μmol/L為順鉑作用48h半數(shù)抑制劑量。順鉑對A2780/DDP細(xì)胞生長抑制也呈劑量時間依賴關(guān)系，特點是：效應(yīng)強度明顯弱于A2780細(xì)胞，尤以低于40μmol/L濃度效應(yīng)弱于A2780中相應(yīng)劑量；效應(yīng)時間明顯滯后， 72h才出現(xiàn)稍明顯生長抑制。故本研究選定4個不同濃度（5、10、20、40μmol/L）順鉑在以下實驗中作為刺激濃度來誘導(dǎo)A2780和A2780/DDP凋亡。

2.2TDT原位標(biāo)記法檢測卵巢癌細(xì)胞凋亡

順鉑培養(yǎng)A2780和A2780/DDP細(xì)胞72h內(nèi)，發(fā)生凋亡細(xì)胞率呈時間劑量依賴，這種趨勢在A2780細(xì)胞中明顯。(10～40)μmol/L順鉑作用A2780細(xì)胞48h和(5～40)μmol/L的順鉑作用A2780細(xì)胞72h，凋亡數(shù)均明顯多于其相同劑量作用24h者。對A2780/DDP細(xì)胞而言，只有當(dāng)20μmol/L和40μmol/L順鉑作用72h時，細(xì)胞凋亡數(shù)才明顯多于其相同劑量作用24h者，見表1。表1順鉑作用A2780和A2780/DDP凋亡陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果A2780細(xì)胞P＜0.05：各時間組間；24h組中從20μM順鉑組起， 48h組和72h組中從10μM順鉑組起，陽性細(xì)胞率明顯增多。A2780/DDP細(xì)胞P＜0.05：72h組中20μM和40μM順鉑組較24h和48h兩組中相同劑量誘導(dǎo)者明顯增多

2.3Western blot檢測Caspase2蛋白表達

Caspase2基因編碼的兩個蛋白Caspase2L和Caspase2S在兩個卵巢癌細(xì)胞系中均有不同程度表達， Western blot中檢測的Caspase2蛋白表達變化實際上是指48Kda的Caspase2L蛋白的改變，其35Kda的Caspase2S蛋白變化不明顯（無特殊說明，以下Caspase2指Caspase2L）。A2780細(xì)胞中Caspase2蛋白在順鉑作用24h和48h時，從10μM順鉑開始其表達增高；隨著順鉑作用時間延長，到72h時，從5μM順鉑即開始表現(xiàn)增高。A2780/DDP中Caspase2蛋白表達在順鉑作用24h和48h的各劑量組間表達無明顯變化；等到順鉑作用72h后，從10μM順鉑起，Caspase2表達開始增高，見圖1、2。

2.4Caspase3蛋白在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP凋亡中表達

Caspase3蛋白病理表現(xiàn)形式主要為胞漿和胞核同時著色，尤以胞核著色明顯。其在A2780細(xì)胞表達隨順鉑作用時間延長和劑量增加有明顯增多趨勢，這種趨勢尤其顯著體現(xiàn)為：24h組中從20 μM順鉑組起，48h組和72h組中從10μM順鉑組起，陽性細(xì)胞率明顯增高。Caspase3蛋白在A2780/DDP細(xì)胞中表達，5μM和10μM順鉑作用下隨時間改變不明顯，當(dāng)順鉑劑量為20μM和40μM時，作用72h后Caspase3蛋白表達有明顯提高，但這種效應(yīng)仍明顯低于A2780細(xì)胞中，見表2。

3討論

3.1順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP凋亡的時間和劑量依從性

腫瘤細(xì)胞對化療耐藥的機制是多方面的[4]。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥系A(chǔ)2780/DDP對順鉑敏感性呈時間和劑量依從關(guān)系。隨著順鉑作用時間延長和劑量增加，對兩細(xì)胞系生長均呈明顯抑制，出現(xiàn)時效和量效相關(guān)性。說明在順鉑耐藥機制中，藥物在體內(nèi)分布和代謝，對血藥有效濃度的影響可能是順鉑敏感性降低的因素之一。隨著劑量增加，細(xì)胞內(nèi)外藥物濃度梯度增加，進入細(xì)胞內(nèi)趨向性增強。這一現(xiàn)象表明卵巢癌細(xì)胞對順鉑敏感性差可能與順鉑進入細(xì)胞存在一定的阻礙。

比較研究A2780和A2780/DDP兩個細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，A2780/DDP需要更高濃度和更長作用時間，才能得到與A2780相同的效果，耐藥細(xì)胞對藥物的進入可能有排斥效果。在臨床上考慮藥物代謝和分布的影響，若提高到與體外實驗相同敏感的劑量，人體是難以耐受其副作用的。這一現(xiàn)象提示在臨床上可用靶向治療方法以提高局部藥物濃度達到治療作用。在除外劑量這一因素后，隨著作用時間延長，A2780/DDP耐藥系出現(xiàn)對順鉑敏感，盡管A2780/DDP對順鉑耐藥，隨著作用時間延長，這種耐藥會被消弱。

3.2細(xì)胞凋亡蛋白Caspase2和Caspase3在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780和耐藥細(xì)胞A2780/DDP凋亡中的表達呈時間和劑量依從性

本研究發(fā)現(xiàn)Caspase2L和Caspase2S蛋白在兩個卵巢癌細(xì)胞系中均有表達，其中Caspase2L蛋白無論從表達量還是變化形式來說，都是A2780和A2780/DDP兩個細(xì)胞系中最主要的表達形式，因此Caspase2對這兩種細(xì)胞凋亡均起正性效應(yīng)[5]。在順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的動態(tài)變化過程中觀察Caspase2蛋白變化情況，則能較好地反映Caspase2的活性。隨著順鉑作用時間延長和劑量增加，Caspase2蛋白的表達呈時間和劑量依從性，這種趨勢在A2780中尤為顯著。進一步研究顯示這種時間和劑量的依從性與相同條件下順鉑誘導(dǎo)A2780和A2780/DDP細(xì)胞凋亡的時間和劑量依從性的變化相吻合。Caspase2蛋白在順鉑敏感系A(chǔ)2780和耐藥系A(chǔ)2780/DDP中發(fā)揮效應(yīng)時間和程度不等，它仍可能是這兩個細(xì)胞系中在順鉑誘導(dǎo)凋亡中起重要作用的Caspase。耐藥卵巢癌細(xì)胞Caspase2蛋白活化延后和程度降低，其上游激活途徑可能受到了明顯抑制。Caspase3是一種重要的凋亡效應(yīng)蛋白，它可對Caspase2參與的線粒體調(diào)節(jié)和隨后線粒體發(fā)生的變化起反應(yīng)，執(zhí)行凋亡命令[6]。Caspase3蛋白在順鉑誘導(dǎo)A2780和A2780/DDP細(xì)胞系凋亡中的表達方式與Caspase2蛋白類似，即Caspase3蛋白表達呈時間和劑量依從性，在順鉑敏感細(xì)胞系突出，且時間和劑量依從性與相同條件下順鉑誘導(dǎo)凋亡的時間和劑量依從性變化一致。有所區(qū)別的是Caspase3在耐藥系A(chǔ)2780/DDP的活性明顯弱于Caspase2蛋白。Caspase3蛋白在卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和A2780/DDP中病理表現(xiàn)形態(tài)多樣化，如胞漿型、胞核型和胞漿胞核型，以胞漿胞核型最常見。從側(cè)面可能反映了Caspase3蛋白在順鉑誘導(dǎo)凋亡中功能活躍。Caspase2和Caspase3蛋白在順鉑誘導(dǎo)其敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐藥系A(chǔ)2780/DDP凋亡中表達均呈時間和劑量依從性，共同表達方式提示這兩種蛋白表達變化可能與其編碼基因突變導(dǎo)致的蛋白活性喪失或降低關(guān)系不大，而與一些外界因素，如進入細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度密切相關(guān)，當(dāng)接觸到足量藥物和作用時間延長，這兩種蛋白在順鉑耐藥的細(xì)胞中均能被活化，發(fā)揮作用。

綜上所述，在順鉑耐藥機制中，藥物在體內(nèi)分布和代謝，對血藥有效濃度的影響和細(xì)胞對藥物排斥引起順鉑進入細(xì)胞存在一定的阻礙可能是降低順鉑敏感性的因素。Caspase2和Caspase3蛋白活化延后和活性降低可能是影響耐藥的A2780/DDP細(xì)胞凋亡的原因。在初次治療卵巢癌或?qū)σ涯退幍穆殉舶┑闹委熤校瑧?yīng)盡可能用提高局部藥物濃度或中小劑量持續(xù)應(yīng)用的方法，可能會產(chǎn)生一些積極的效果。

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