作者：郭璐，魏虎來， 張亞莉， 劉建民

【摘要】 目的 研究維生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate， VES）誘導多藥耐藥K562/ADM細胞凋亡的分子機制。方法 采用四氮唑藍比色法（MTT）檢測K562/ADM增殖活性；細胞形態(tài)學和Annexin V/PI雙標記法檢測細胞凋亡；RTPCR檢測mdr1基因和Caspase3基因mRNA的表達；流式細胞法（FCM）測定Pgp蛋白表達水平和Caspase3活性。結(jié)果 VES顯著抑制K562/ADM細胞的增殖；經(jīng)VES處理后細胞形態(tài)上出現(xiàn)典型的凋亡改變；Annexin Ⅴ/PI雙染檢測凋亡細胞明顯增加；mdr1 mRNA表達和P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）合成明顯降低，Caspase3 mRNA表達和Caspase3活性顯著增強；VES增加K562/ADM細胞對ADM的敏感性。結(jié)論 VES誘導mdr1/Pgp高表達的K562/ADM耐藥細胞凋亡，其主要機制為下調(diào)mdr1/Pgp表達而逆轉(zhuǎn)Pgp介導的細胞凋亡抑制和耐藥性。

【關(guān)鍵詞】 維生素E琥珀酸酯多藥耐藥凋亡抑制P糖蛋白；Caspase3；白血病

Key words：Vitamin E succinate; Multidrug resistance; Apoptosis resistance; Pglycoprotein; Caspase3; Leukemia

維生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate， VES）是α生育酚的6位羥基與琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究證實，VES可選擇性地殺傷人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞，而對正常細胞無抑制效應(yīng)[13]。有關(guān)VES對耐藥白血病（腫瘤）細胞作用的研究少見，我們曾研究證實VES可抑制白血病K562/ADM耐藥細胞增殖并誘導其凋亡[4]。本文以白血病多藥耐藥K562/ADM細胞為模型，觀察VES誘導其凋亡過程中耐藥基因mdr1及其編碼產(chǎn)物P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）表達的變化，探討VES誘導耐藥細胞凋亡的分子機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

維生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate， VES）為美國Sigma公司產(chǎn)品，用無水乙醇配制成50 mmol/L的儲存液。RPMI1640為美國Gibco BRL公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素（ADM）為日本明治制藥公司產(chǎn)品。MTT、SDS、瓊脂糖、RNase、溴化丙錠（EB）、碘化丙啶（PI）和二乙基焦碳酸（DEPC）均由美國Sigma公司出品。100bp DNA Ladder Marker由美國Promega公司出品。抗Pgp單抗（MRK16）為Kamiya Biomedical公司產(chǎn)品，PE標記的羊抗鼠IgG2a為Caltag公司產(chǎn)品。TRIZOL試劑由美國Invitrogen公司生產(chǎn)。AMV一步法RTPCR試劑盒購自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase3和βactin基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC標記的DEVDFMK和Annexin V試劑盒為Biovision公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

K562/ADM多藥耐藥白血病細胞由蘭州大學醫(yī)學實驗中心保存，細胞在含有15%小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mmol/L L谷氨酰胺的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，定期添加ADM（～5.0mg/L）以刺激mdr1/Pgp高表達。細胞在無ADM的條件下培養(yǎng)1周后用于實驗。

1.3 細胞增殖活性

K562/ADM細胞以2×108/L接種于96孔培養(yǎng)板（Costar）中，分別加入10～60μmol/L VES，對照組加入終濃度<0.2%（V/V）的無水乙醇。培養(yǎng)24～96h后MTT比色法[5]檢測，并計算細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

VES處理后的K562/ADM細胞，細胞離心涂片機（StatSpin Cytofuge 2型）離心涂片，WrighGiemsa染色，光鏡觀察。同時收集細胞，3%戊二醛固定，經(jīng)脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鈾鉛雙重染色，透射電鏡（JEM1230）觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 Annexin Ⅴ/PI雙標記檢測凋亡細胞

按試劑盒說明操作。收集K562/ADM細胞，PBS洗滌，重懸于Binding Buffer中，加入PI和FITC 標記的Annexin Ⅴ， 室溫避光染色5min，流式細胞儀（BeckmanCoulter Epics XL）檢測[6]。

1.6 RTPCR檢測mdr1和Caspase3基因mRNA表達

TRIZOL法提取細胞總RNA，以βactin為內(nèi)參照，AMV一步法RTPCR檢測 mdr1和Caspase3 基因mRNA表達情況。引物分別為：mdr1：上游5’CCCATCATTGCAATAGCAGG3’，下游5’GTTCAAACTTCTGCTCCTGA3’，擴增產(chǎn)物167bp；Caspase3:上游5’CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG3’，下游5’GCATACTGTTTCAGCATGGCAC3’，擴增產(chǎn)物272 bp；βactin：上游5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’，下游5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’，擴增產(chǎn)物548bp。PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)（Syngene ChemiGenius 2）分析。

1.7 Pgp表達測定

收集K562/ADM細胞，PBS洗滌，分別加入鼠抗人Pgp單抗MRK16（一抗）和PE標記的羊抗鼠IgG2a（二抗），F(xiàn)CM檢測Pgp的表達陽性率和平均熒光強度（MFI）[7]。

1.8 Caspase3活性測定

根據(jù)試劑盒說明操作。收集細胞，PBS洗滌，加入FITCDEVDFMK，37℃孵育1h，洗滌，F(xiàn)CM檢測活化Caspase3活性[8]。

1.9 藥物敏感性

K562/ADM細胞經(jīng)20μmol/L和40μmol/L VES與不同濃度的ADM聯(lián)合處理48h，細胞終止培養(yǎng)后MTT比色法[5]檢測并計算細胞增殖抑制率。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性分析和直線回歸。

2 結(jié)果

2.1 VES誘導K562/ADM細胞凋亡

VES呈時間和濃度依賴性地抑制K562/ADM細胞增殖（P<0.01）， 24h、48h、72h和96h的IC50分別為77.9μmol/L、66.3μmol/L、49.7μmol/L和39.9μmol/L。經(jīng)20μmol/L和40μmol/L VES處理后，K562/ADM細胞出現(xiàn)胞膜起泡，染色質(zhì)凝集、核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡形態(tài)學改變，見圖1。Annexin V/PI染色顯示凋亡細胞明顯增高，20μmol/L和40μmol/L VES處理24h細胞凋亡率分別為29.0%和54.7%，48h為60.8%和74.8%。證實VES對K562/ADM細胞有明顯的增殖抑制效應(yīng)，并促使細胞凋亡。

2.2 VES下調(diào)K562/ADM細胞mdr1 mRNA表達，抑制Pgp合成K562/ADM細胞mdr1/Pgp呈高表達。20μmol/L和40μmol/L VES后，mdr1 mRNA表達下降，凝膠圖像分析，48h的表達抑制率分別為8.78%和46.54%，見圖2； Pgp合成顯著降低，72h時Pgp表達陽性率由98.2%降低至87.8%～75.1%，表達強度（MFI）降低約50%，見圖3。

2.3 VES上調(diào)K562/ADM細胞Caspase3基因mRNA的表達，增強Caspase3活性 K562/ADM細胞Caspase3基因mRNA呈微弱表達。經(jīng)20μmol/L和40μmol/L VES處理，Caspase3 mRNA表達明顯增高，凝膠圖像分析顯示分別增高24.3%和84.3%，見圖2；Caspase3活性顯著增強，活化Caspase3由9.3%增高至21.3%和39.8%，見圖3。

2.4 VES增加K562/ADM細胞對ADM的敏感性

20μmol/L和40μmol/L VES 與不同濃度ADM共同作用48h，對K562/ADM細胞產(chǎn)生聯(lián)合增殖抑制效應(yīng)（P<0.05），見圖4。VES與ADM的聯(lián)合效應(yīng)可能是VES抑制K562/ADM細胞Pgp表達，提高耐藥細胞對抗癌藥物ADM的敏感性，逆轉(zhuǎn)細胞抗藥性和凋亡抑制。

白血病多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）的發(fā)生均伴隨著細胞凋亡抑制（Apoptosis resistance）現(xiàn)象，絕大多數(shù)常規(guī)抗癌藥物幾乎不能誘導耐藥細胞凋亡。K562/ADM細胞是經(jīng)阿霉素（ADM）長期誘導而獲得的mdr1/Pgp超表達的白血病耐藥細胞，對ADM、柔紅霉素（DNR）、米托蒽醌（MIT）、高三尖杉酯堿（HHT）和足葉乙甙（Vp16）等抗癌藥物表現(xiàn)出復雜的交叉耐藥[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Pgp除作為一種能量依賴“藥泵”主動性地將藥物從細胞內(nèi)排出而導致耐藥外，還通過抑制Caspase3和Caspase8等的激活而介導耐藥細胞的凋亡抑制[7，10，11]，因此，Pgp在白血病耐藥細胞凋亡抑制的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。

維生素E琥珀酸酯（VES）作為一種潛在的腫瘤細胞生長抑制劑，其抗腫瘤作用機制包括抑制腫瘤細胞DNA合成，誘導凋亡；阻斷細胞周期使腫瘤細胞停滯于G1期；誘導細胞分化；促進轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β， TGFβ）分泌與活化及TGFβⅡ型受體的表達；促進腫瘤細胞表面Fas（CD95/APO1）的表達等[13，12]。我們以前的研究證實VES可抑制耐藥白血病細胞增殖，并誘導其凋亡[4]。白血病細胞發(fā)生MDR后，其生物學特性發(fā)生了很大的變化，因此，VES誘導耐藥細胞凋亡的機制也可能異于藥物敏感細胞。本研究發(fā)現(xiàn)，VES誘導K562/ADM耐藥細胞凋亡過程中，mdr1 mRNA表達水平和Pgp合成量顯著降低，而Caspase3 mRNA表達水平和Caspase3活性則明顯增高，呈劑量和時間依賴性；同時發(fā)現(xiàn)VES可顯著提高K562/ADM細胞對ADM的敏感性。鑒于Pgp在白血病耐藥細胞耐藥性和凋亡抵抗中的關(guān)鍵作用，我們的研究結(jié)果提示VES誘導白血病耐藥細胞凋亡的機制與其抑制mdr1/pgp表達，解除Pgp對Caspase3等的抑制效應(yīng)，并增加抗癌藥物的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)因Pgp高表達所介導的凋亡抑制和細胞耐藥有關(guān)。

多藥耐藥白血病（腫瘤）細胞的凋亡抵抗現(xiàn)象和干預(yù)對策是目前腫瘤耐藥研究的熱點之一，鑒于維生素E及其衍生物的特性，深入研究其在干預(yù)白血病（腫瘤）耐藥細胞凋亡抑制的作用及其可能的分子機制，將為臨床耐藥白血病（腫瘤）開發(fā)更新、更有效的治療藥物提供依據(jù)。

【