【關(guān)鍵詞】 分枝桿菌藥物外排泵

近年來，分枝桿菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴重，耐多藥結(jié)核分枝桿菌也日漸增多，導致其感染的難治性。分枝桿菌內(nèi)在性耐藥主要是細胞壁通透性障礙，導致藥物進入高疏水性細胞壁間隙比較慢；而獲得性耐藥主要是基因突變，導致抗生素靶位變異或藥物在細胞內(nèi)處于無活性狀態(tài)。但僅憑天然細胞壁屏障作用和基因突變因素尚不足以解釋分枝桿菌耐藥機制。研究表明，分枝桿菌存在藥物主動外排泵的表達，并被視為是可能的另一種重要耐藥機制〔1，2〕。現(xiàn)就分枝桿菌外排泵的生物學功能及其基因調(diào)控機制研究進展綜述如下。

1 分枝桿菌外排泵生物學功能

研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌外排泵能將菌細胞內(nèi)藥物泵出，使得胞內(nèi)藥物濃度不能有效抑制分枝桿菌生長，從而產(chǎn)生抗生素耐受性〔3，4〕。 藥物外排系統(tǒng)根據(jù)其蛋白氨基酸同源性可分成很多種類〔4〕，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組有20個編碼假想外排泵的開放閱讀框（ORF）〔5〕。目前僅有幾種分枝桿菌外排泵得到一定研究，分別為屬于主要易化超家族（MFS）的Lfr A、Rv1634、EfpA 、Tet(V)、P55、Tap、Rv1258c；屬于耐受小節(jié)分裂區(qū)家族（RND）的MmpL；屬于ATP結(jié)合盒超家族（ABC）的DrrAB、Pst、Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c；屬于小耐多藥性家族（SMR）的Mmr等。這些藥物外排泵蛋白轉(zhuǎn)運氟喹諾酮類（FQs）、四環(huán)素、氨基糖苷類藥物及其他化合物。

11 MFS類

生物信息學分析結(jié)核分枝桿菌基因組有16個ORF編碼假想的藥物外排泵屬于MFS類〔6〕。

111 分枝桿菌MFS外排泵轉(zhuǎn)運FQs

（1）Lfr A：分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個功能外排泵，具有較廣的底物專一性，但其外排作用僅限于親水性較高的FQs。Takiff等〔7〕從一株耐環(huán)丙沙星恥垢分枝桿菌中克隆基因lfrA，將之轉(zhuǎn)染恥垢分枝桿菌敏感菌mc2155株后，賦予該菌對FQs低水平耐藥。對LfrA蛋白氨基酸序列預測性分析顯示其與屬于MFS的金黃色葡萄球菌QacA蛋白同源，推測LfrA蛋白是MFS類外排泵蛋白。Liu等〔8〕證實，LfrA蛋白涉及幾種喹諾酮抗生素的排出，肯定了Takiff的推測。Sander等〔9〕研究恥垢分枝桿菌lfrA基因插入失活突變株時，也發(fā)現(xiàn)溴乙錠和吖啶黃最小抑菌濃度（MIC）降低，認為可能是LfrA外排機制的作用。（2）Rv1634：Rossi等〔10〕發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Rv1634基因編碼另一種假想的MFS類外排泵Rv1634。當它在恥垢分枝桿菌過度表達時，賦予氟喹諾酮類藥物敏感性降低。蓄積數(shù)據(jù)顯示，這個泵與氟哌酸和環(huán)丙沙星外排有關(guān)。（3）EfpA：Doran等〔11〕發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株efpA基因編碼假想外排泵蛋白EfpA，其在蛋白二級結(jié)構(gòu)上與LfrA同源。該蛋白也導致對氟喹諾酮耐藥。恥垢分枝桿菌efpA基因缺失株與野生株比較，其對溴乙錠、慶大霉素、氟喹諾酮和吖啶黃敏感性增加2～8倍，但對利福霉素、氯霉素、異煙肼和紅霉素敏感性卻降低2～4倍〔4〕。EfpA在耐藥中的作用和它的底物專一性仍有待進一步研究。

112 分枝桿菌MFS外排泵轉(zhuǎn)運四環(huán)素、氨基糖苷類 （1）Tet(V)：Tet(V)是分枝桿菌四環(huán)素外排泵〔12〕。四環(huán)素對臨床分離的幾種快速生長的偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等都有抗菌活性。tet(V)基因序列分析顯示，其與編碼其他已知的革蘭陽性菌四環(huán)素轉(zhuǎn)運體基因相似。恥垢分枝桿菌Tet(V)外排泵的過度表達使得四環(huán)素MIC增加2～4倍，但對四環(huán)素衍生物強力霉素和美滿霉素卻無影響。（2）P55：Sliva等〔13〕根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因組信息，克隆并表達了可能的外排泵蛋白Rv1410c，命名為P55。研究表明，P55存在于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、鳥分枝桿菌和麻風分枝桿菌等多種分枝桿菌中。將攜帶P55編碼基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染恥垢分枝桿菌后，重組細菌表現(xiàn)出對氨基糖苷類和四環(huán)素耐藥。在泵抑制劑碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）和維拉帕米作用下，其耐藥性降低。表達P55的恥垢分枝桿菌胞內(nèi)四環(huán)素蓄積量明顯小于對照株。故推測P55蛋白是分枝桿菌中執(zhí)行氨基糖苷類和四環(huán)素外排泵功能的蛋白。（3）Tap：Ainsa等〔14〕從偶發(fā)分枝桿菌基因組中克隆tap基因，將之轉(zhuǎn)染mc2155后，表現(xiàn)出低水平耐氨基糖苷類和四環(huán)素。蛋白結(jié)構(gòu)分析，Tap有20％～30％氨基酸序列與MFS家族成員特別是四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯類泵蛋白一致。其底物包括四環(huán)素和某些氨基糖苷類藥物。Martin等〔15〕也發(fā)現(xiàn)，Tap蛋白利用跨膜電化學梯度將四環(huán)素從胞內(nèi)擠出。這種外排活性被CCCP和利血平抑制，這一結(jié)果與在有這些抑制劑存在時的MIC下降一致。（4）Rv1258c：結(jié)核分枝桿菌Rv1258c基因與偶發(fā)分枝桿菌tap基因同源。Siddiqi等〔16〕 研究臨床分離耐多藥結(jié)核分枝桿菌株ICC154時發(fā)現(xiàn)，Rv1258c轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，與結(jié)核分枝桿菌對四環(huán)素內(nèi)在性耐藥有關(guān)。根據(jù)其以往的研究〔17〕，排除了ICC154基因突變所致，認為可能是Rv1258c基因過度表達所致。

12 RND類

結(jié)核分枝桿菌基因組序列包含編碼可能的預測屬于RND家族轉(zhuǎn)運體蛋白的跨膜蛋白的15個基因，這些編碼于分枝桿菌的蛋白命名為MmpL(mycobacterial membrane proteins，large)。Pasca發(fā)現(xiàn)〔18〕，mmpL7基因在恥垢分枝桿菌表達時對異煙肼高度耐藥，該耐藥在利血平和CCCP存在時有所減弱。另外在恥垢分枝桿菌在能量依賴型外排異煙肼也能檢測到有mmpL基因表達。

13 ABC超家族

編碼ABC轉(zhuǎn)運體的基因占結(jié)核分枝桿菌基因組約2.5％。至少有37個完整或不完整ABC轉(zhuǎn)運體已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)〔19〕，其作用底物非常廣泛，包括FQs、利福平、四環(huán)素、紅霉素等。

131 DrrAB

結(jié)核分枝桿菌基因組中有阿霉素耐藥操縱子drrAB。麻風分枝桿菌和鳥分枝桿菌中也存在同源基因。２個轉(zhuǎn)錄成對的開放閱讀框drrA、drrB可編碼ABC轉(zhuǎn)運體。drrA編碼核苷酸結(jié)合區(qū)域，drrB編碼細胞膜上蛋白亞基。其具有泵功能的結(jié)構(gòu)是drrA2B2。drrA結(jié)合于細胞膜依賴于drrB的同時表達。在缺失drrA時，drrB很容易被蛋白水解酶水解，兩者同時表達，才能形成具有功能的藥物外排泵。Choudhuri〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，drrAB在恥垢分枝桿菌中表達時，表現(xiàn)出對利福平、四環(huán)素、紅霉素等一系列臨床常用抗生素耐藥。用泵抑制劑處理后，耐藥明顯受到抑制，說明DrrAB在結(jié)核分枝桿菌耐藥中存在作用。

132 Pst

磷酸鹽轉(zhuǎn)運體Pst(phosphate specific transporter)存在于多種微生物，主要涉及磷酸鹽運輸，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其可能還與胞內(nèi)氟喹諾酮外排有關(guān)。Banerjee〔21〕認為，Pst能將胞內(nèi)的氟喹諾酮排出胞外，恥垢分枝桿菌耐環(huán)丙沙星突變株受氟喹諾酮類抗生素作用48h后，Pst系統(tǒng)中編碼PstB(ATP酶亞基)的mRNA水平明顯升高。而PstB的失活將導致菌株對氟喹諾酮非常敏感。Poole〔22〕也證實，恥垢分枝桿菌Pst高表達導致環(huán)丙沙星耐藥，而用外排泵抑制劑維拉帕米可逆轉(zhuǎn)此耐藥。

133 Rv2686cRv2687cRv2688c

Pasca等〔23〕研究表明，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中存在一個編碼屬于ABC轉(zhuǎn)運子家族的氟喹諾酮排出泵蛋白的操縱子，Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c，這3個基因是共同表達的。研究該蛋白功能發(fā)現(xiàn)，其過度表達的恥垢分枝桿菌，環(huán)丙沙星高度耐藥。而僅Rv2686c過度表達時，環(huán)丙沙星中度耐藥。對諾氟沙星則不管是表達完整的操縱子還是僅為Rv2686c，突變株低水平耐藥。對這一現(xiàn)象，Pasca分析可能是由于Rv2686c蛋白與宿主細胞內(nèi)相關(guān)蛋白相互作用，形成一個藥物轉(zhuǎn)運體的緣故。用利血平和維拉帕米處理，則可以誘導環(huán)丙沙星MIC降至與野生株一致的水平，表明該轉(zhuǎn)運體發(fā)揮有主動外排藥物的作用。

14 SMR家族

在分枝桿菌的SMR家族中，目前僅找到mmr基因〔24〕。它存在于結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌、海洋分枝桿菌等分枝桿菌染色體基因組中。蛋白序列對比程序BLASTP分析顯示，Mmr蛋白同SMR外排家族中的QacE、EmrE等蛋白同源程度很高，也有4個跨膜片段。將結(jié)核分枝桿菌的mmr基因轉(zhuǎn)染至mc2155，顯示出對紅霉素和溴乙錠等耐藥，而對利福平和鏈霉素等則無影響。

2 分枝桿菌外排泵相關(guān)基因調(diào)控

機制外排泵基因通常是一個操縱子的一部分，其表達受一個調(diào)節(jié)基因控制，過度表達可能有害是因為其表達后直接地、自然地破壞了膜融合或是不必要地輸出了必需代謝產(chǎn)物。對于分枝桿菌外排泵的有關(guān)調(diào)控機制，目前僅在恥垢分枝桿菌LfrA和結(jié)核分枝桿菌P55有初步研究。 21 LfrA/LfrR操縱子 Li Xian〔4〕發(fā)現(xiàn)，編碼LfrA外排泵的基因lfrA的表達受抑制基因lfrR調(diào)控。lfrA基因上游區(qū)域的序列分析顯示存在一個編碼推測為含195個氨基酸的多肽的ORF，LfrR。lfrR和lfrA被認為組成一個操縱子。最近Buroni〔25〕也證實，LfrR是調(diào)控恥垢分枝桿菌外排泵LfrA表達的抑制子。lfrR基因編碼可能的四環(huán)素外排泵TetR家族轉(zhuǎn)錄抑制子〔4〕，lfrR基因缺失顯示lfrA表達增強，增加了突變菌株對環(huán)丙沙星、氟哌酸、溴乙錠和吖啶黃的耐藥性。LfrA的這種表達增強對高耐藥株的形成具有重要作用，推測可能是lfrA高表達增加了高水平耐藥突變的頻率〔7，8〕，因其容許在低耐藥濃度中存活而選擇繼發(fā)的高耐藥突變，比同步選擇雙突變的頻率高，而其他無關(guān)的突變更加頻繁，這可能是細菌如何進行性成為高耐藥、多耐藥的機制提供一種模式。 22 P27/P55操縱子 牛分枝桿菌基因組中，P55基因位于編碼免疫原性脂蛋白P27基因下游區(qū)〔13〕。Bigi F〔26〕等在研究P55外排泵蛋白時，采用Northern blotting和RTPCR證實P27和P55組成一個轉(zhuǎn)錄單位，P27/P55操縱子。近期研究發(fā)現(xiàn)〔27〕，編碼P27/P55操縱子的基因lprGRv1410的敲除可導致結(jié)核分枝桿菌減毒作用的發(fā)生。Silva〔13〕等檢測了質(zhì)粒pPAZ24（有一個鏈霉素耐藥Ω盒子序列插入P27基因序列，從而阻礙了操縱子啟動子作用下P55的轉(zhuǎn)錄）。結(jié)果顯示，P55在盒子和P55起始密碼子之間約390個核苷酸處有一個啟動子。某些細菌有藥物傳感器蛋白，可誘導與之相連的外排泵蛋白基因的表達。在這些情況中，編碼藥物傳感器蛋白的基因和外排泵蛋白基因彼此相鄰。因為脂蛋白被認為參與信息轉(zhuǎn)導，他們推測P27也是特殊信號傳感器的一種，直接或間接激活P55的表達。當然這還需要進一步研究。