【關鍵詞】 卵巢癌，紫杉醇耐藥，P

Expressions of PKCα and Pgp in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol

【Abstract】 AIM: To detect the expressions of Pglycoprotein （Pgp）and protein kinase Cα(PKC α) isoform in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol. METHODS: Immunohistochemical SP method and doublelabeled immunofluorescence were used to determine the expressions of Pgp and PKCα in A2780/Taxol and A2780.Western Blot was employed for assess Pgp expression after A2780/Taxol was cocultured with phorbol myristate acetate(PMA) or staurosporine (SP). RESULTS: There was a coexpression of Pgp and PKCα in A2780/Taxol， but Pgp was not expressed in A2780.And the expression level of Pgp in A2780/Taxol was not affected by the presence of PMA and SP. CONCLUSION: Pgp and PKCα play important roles in the resistance of ovarian cancer cell A2780 to taxol.

【Keywords】 ovarian neoplasms; Taxol resistance， Pglycoprotein; protein kinase C

【摘要】目的： 探討PKCα與Pgp在紫杉醇誘導的卵巢癌耐藥細胞系A2780/Taxol中的表達. 方法： 免疫細胞化學SP法及免疫熒光雙標檢測PKCα與Pgp在耐藥細胞A2780/Taxol及其親本細胞中的表達； Western Blot檢測并半定量分析PKC激動劑佛波脂(PMA)和抑制劑十字孢堿(SP)作用后Pgp在兩種細胞上的表達水平. 結果： 免疫細胞化學結果表明在A2780/Taxol中，Pgp與PKC表達均呈陽性，而在親本細胞中，Pgp不表達，PKC呈陽性表達. 在A2780/Taxol中PKCα與Pgp有共表達. SP及PMA作用后，A2780/Taxol細胞Pgp表達無明顯差別. 結論： 卵巢癌對紫杉醇耐藥的產生與PKCα和Pgp有關. 【關鍵詞】 卵巢癌，紫杉醇耐藥，P糖蛋白，蛋白激酶C

0引言 紫杉醇在卵巢癌化療中占有重要地位，而耐藥是影響療效的重要因素. 多藥耐藥基因(mdr1)編碼的P糖蛋白(Pglycoprotein， Pgp)的過表達是紫杉醇耐藥機制之一，而Pgp是由蛋白激酶C(protein kinase C， PKC)磷酸化而發揮功能的，在PKC眾多同功酶中又以α同功酶(PKCα)與多藥耐藥(multi drug resistence， MDR)關系最為密切. 因此我們培養紫杉醇誘導的卵巢癌耐藥細胞，研究其Pgp及PKCα的表達，為逆轉耐藥提供依據. 1材料和方法

1.1材料卵巢癌細胞系 A2780及其紫杉醇耐藥孕系(A2780/Taxol)由王澤華教授惠贈，培養于含有100 mL/L小牛血清的DMEM完全培養基，置于37℃， 50 mL/L CO2，相對濕度90% 的培養箱中培養；試劑 DMEM 購于Gibco公司，鼠抗人MDR1 mAb及兔抗人PKCα pAb購于Boster公司，SP免疫組化試劑盒，羅丹明標記的羊抗兔IgG及FITC標記的羊抗鼠IgG購于北京中山金橋生物技術公司，十字孢堿(SP)和佛波脂(PMA)購于Sigma公司.

1.2方法

1.2.1細胞爬片A2780和A2780/Taxol細胞按2×106個/L濃度接種于裝有防脫處理的蓋玻片的6孔板中培養24 h，取出爬片，10 mol/L PBS沖洗2次，950 mL/L 乙醇固定10 min，中性樹膠黏于載玻片上.

1.2.2免疫組化SP染色取上述細胞爬片，封閉后分別滴加鼠抗人MDR1 mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100)， DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片.

1.2.3免疫熒光雙染細胞爬片同上，滴加MDR1 mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100)，4℃冰箱孵育過夜，滴加FITC標記的羊抗鼠IgG和羅丹明標記的羊抗兔IgG，PBS振洗，甘油封片. 同時設PBS代替一抗的陰性對照. 1.2.4Western Blot實驗分組1組： A2780細胞陰性對照組，2組： A2780/Taxol細胞組；3組： A2780/Taxol細胞+PMA組： 培養A2780/Taxol細胞，PMA濃度200 nmol/L與細胞共同孵育40 min后收集細胞；4組A2780/Taxol細胞+SP組： 培養A2780/Taxol細胞，SP濃度100 nmol/L與細胞共同孵育2 h后收集細胞. 按文獻［1］提取總蛋白，Lowry法定量，取20 μg蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度5%，并電轉移至硝酸纖維素膜上，用含10 mol/L BSA的TBST 4℃冰箱封閉過夜，加入兔抗人Pgp pAb（1∶500），室溫輕搖60 min，加入羊抗兔APIgG，顯色液避光顯色2 min，同時，以βactin作內參. Western Blot結果以Image軟件做圖像弧度掃描，半定量采用與βactin的灰度比計算. 統計學處理： 以SPSS統計軟件對結果進行統計分析，采用多樣本snkq檢驗.

2結果

2.1Pgp在A2780/Taxol細胞中的表達免疫細胞化學SP染色結果表明Pgp在A2780/Taxol細胞中表達為陽性（圖1），在A2780細胞中不表達；PKCα在兩種細胞中均表達，在A2780/Taxol細胞中表達呈強陽性(圖2)；免疫熒光雙標結果示Pgp與PKCα在A2780/Taxol細胞中有共表達現象，在A2780細胞中僅有紅色熒光，即僅有PKCα的表達（圖3）.

圖1－圖3略

2.2SP和PMA作用后Pgp在A2780/Taxol細胞中的表達A2780/Taxol組在Mr為170×103位置有明顯條帶. Western Blot半定量結果顯示： A2780/Taxol組，A2780/Taxol+PMA， A2780/Taxol+SP組Pgp與βactin的灰度掃描值分別是28.93%， 29.34%， 28.57%，差異無統計學意義(P>0.05)，說明3，4組，與2組相比Pgp表達量并無明顯增加或減少（圖4）.

圖4略

3討論

紫杉醇耐藥的機制很多，目前比較確定的有Pgp表達的升高，微管β亞基的改變，微管α亞基的改變及凋亡途徑改變. MDR1基因編碼的Pgp是一種跨膜轉運蛋白，具有ATP酶活性，能將化療藥物從細胞內泵出，降低細胞內的有效藥物濃度而致多藥耐藥［2］. PKC是一種普遍存在的磷脂依賴性酶，與細胞增殖，分化，凋亡的信號轉導息息相關， 也參與了多MDR形成過程的調控［3］. Gottesman等［4］在早期的研究中證明Pgp是由PKC磷酸化的，磷酸化后的Pgp活化而具有跨膜轉運功能，并且這種磷酸化過程能夠被verapamil抑制，而被PKC激活劑增強［5］，PMA就與PKC具有高親和力，可以激活PKC. 而現已證實PKC存在至少11種不同亞型，它們都是由不同基因編碼的功能相似的同功酶，廣泛分布在各器官組織和細胞，它們在結構，生化性質，組織分布，亞細胞定位和底物特異性方面都有差別［6］. 韓英等［7］檢測了PKCα，βⅠ在胃癌及其長春新堿耐藥株中的表達，結果表明胃癌細胞SGC7901/ VCR 的耐藥機制可能與PKCα有關，而與PKCβⅠ無明顯相關性，相關實驗還表明PKC可能通過調節Pgp 的功能與表達而參與胃癌細胞多藥耐藥的形成. 這說明在PKC的眾多亞型中，尤以α亞型與Pgp磷酸化關系最為密切［8］. 本實驗我們采用Western Bolt檢測Pgp的表達，結果顯示A2780細胞表達呈陰性，而A2780/Taxol細胞中Pgp的表達呈陽性，表明卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性產生與Pgp過表達有關. 該實驗還通過免疫組化檢測到在A2780/Taxol細胞中PKCα表達強于其在A2780細胞中的表達，這個結果說明Pgp通過PKCα活化而發揮功能，與上述理論相符，因此在免疫熒光雙標實驗中可以很清晰地看到Pgp與PKCα的共表達. 本試驗我們還使用PKC激動劑PMA和抑制劑SP分別作用于A2780/Taxol細胞，通過Western Blot檢測和半定量分析并未發現個組間Pgp表達有差別，這說明PKCα活性的增強或減弱在短時間作用后并不能使Pgp表達量增加.

然而，不同亞型同功酶在卵巢癌對紫杉醇耐藥中起什么樣的作用，對Pgp的表達和功能有什么影響，以及SP和PMA長時間作用后能否影響Pgp的表達量，還有待進一步實驗. 這些研究將對卵巢癌患者的化療具有重要意義.

［1］ Sambiuok J， Fritsch EF， Maniatis T． 分子克隆［M］． 金冬雁，黎盂楓. 譯． 2版． 北京： 科學出版社．1996:889-890.

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［5］ Minko T， Batrakova EV， Li s， et al. Pluronic block copolymers alter apoptotic signal transduction of doxorubicin in drugresistant cancer cells［J］.J Control Release， 2005，105(3):269-278.

［6］ Varma MV， Ashokraj Y， Dey CS， et al. Pglycoprotein inhibitors and their screening: A perspective from bioavailability enhancement［J］. Pharmacol Res， 2003，48(4):347359.

［7］ 韓英，時永全，鄭悅，等. 胃癌耐藥細胞系傳統型蛋白激酶C的表達及活性［J］ . 第四軍醫大學學報， 2001，22(15):1358 -1361.

［8］ Hrycyna CA. Molecular genetic analysis and biochemical characterization of mammalian Pglycoproteins involved in multidrugresistance［J］.Semin Cell Dev Biol， 2001，12(3):247-256.