作者：賈寧，徐志凱，袁云娥，索繼江，邢玉斌

【關鍵詞】 表皮葡萄球菌；，生物膜；，實時定量;，逆轉錄聚合酶鏈反應

Relationship between expressions of global regulators and erythromycin resistance of Staphylococcus epidermidis biofilm

【Abstract】 AIM: To explore the relationship between the expressions of global regulators and the erythromycin resistance of Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) biofilm. METHODS: The expressions of global regulators (agr， sarA and sigB) in biofilm cells of S. epidermidis 1457 with and without erythromycin resistance were detected by SYBR green I realtime RTPCR. RESULTS: The expressions of agrD and RNAIII were significantly higher in biofilm cells than those in planktonic cells in both erythromycin and nonerythromycin groups （P<0.05）. The expression of sarA in biofilm cells was significantly higher than that in planktonic cells， but there was no significant difference in biofilm cells between erythromycin group and nonerythromycin group. The expression of sigB and its active regulation gene asp23 in biofilm cells showed no significant difference between erythromycin and nonerythromycin groups (P>0.05). CONCLUSION: agrD and RNAIII take part in quorumsensing regulation， which suggests that quorumsensing system plays an important role in erythromycin resistance of S. epidermidis biofilm.

【Keywords】 Staphylococcus epidermidis; biofilm; realtime quantitative; RTPCR

【摘要】 目的：探討表皮葡萄球菌全面調節子的表達在生物被膜耐藥性中的作用. 方法：采用實時熒光定量RTPCR對表皮葡葡球菌1457生物被膜內細菌紅霉素作用前后全面調節子(agr， sarA， sigB)的表達進行檢測. 結果：在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ在膜內菌中的表達均高于浮游菌，且紅霉素作用24 h后的表達高于作用前（P<0.05）；sarA膜內菌的表達高于浮游菌（P<0.05），但紅霉素作用前后的表達無統計學差異（P>0.05）；膜內菌sigB和反應sigB 調控的活性基因asp23的表達紅霉素作用前后無統計學差異（P>0.05）. 結論：由于agrD和RNAⅢ參與群體效應系統的調節，提示群體效應調節在紅霉素耐藥性增加中起著重要作用.

【關鍵詞】 表皮葡萄球菌；生物膜；實時定量;逆轉錄聚合酶鏈反應

0引言

表皮葡萄球菌吸附于機體粘膜或插管、人工關節等生物醫學材料表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂多糖等多糖復合物，相互粘連并克隆產生生物被膜. 生物被膜的產生使膜內菌對抗生素的耐藥性比浮游菌增加10~1000倍， 其引發的感染常常只有移走植入物才能控制［1］. 生物膜內細菌如何形成對抗生素的耐藥性，目前還不十分清楚，相關的研究報道較少. 不同的生物被膜的組成和不同的抗生素，其耐藥機制也不相同［2-3］. 我們采用實時熒光定量RTPCR檢測表皮葡葡球菌1457不同狀態下基因表達水平，探討表皮葡萄球菌生物被膜對紅霉素的耐藥機制.

1材料和方法

1．1材料

表皮葡萄球菌1457為iCa+的產生物被膜菌，由Micheal Otto教授惠贈，紅霉素最小抑菌濃度為0.25 μg/mL. 表皮葡萄球菌過夜搖動增菌并稀釋至吸光度為0.2（A600 nm）；取5 μL接種于培養基（含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L）平板上的0.2 μm聚碳酸酯微孔濾膜上（直徑約25 mm），35℃孵育48 h，濾膜及所生成的生物被膜每隔12 h轉移到新的平板上［4］. 聚碳酸酯微孔濾膜（Whatman Inc，USA）購于聯星生物有限公司，使用前121℃高壓15 min.

1．2方法

1．2．1總RNA的提取

按Qiagen RNA提取試劑盒說明書提取總RNA. 使用RNasefree DNase set 去除樣品中的基因組污染； 用50 μL RNasefree water洗脫RNA， 加入 RNA酶抑制劑； 純化的RNA -20℃保存.

1．2．2實時熒光檢測

采用Takara實時熒光定量PCR試劑盒進行實時定量PCR檢測agrD， RNA III， sigB， asp23， sarA基因的表達. PCR引物由大連寶生物合成. 使用1457浮游菌總RNA樣品轉錄成cDNA梯度稀釋為10-7， 10-8， 10-9， 10-10， 10-11 g/μL作為標準品，進行PCR反應，制作16S rRNA標準曲線和cDNA梯度稀釋為10-8~10-12 g/μL，作為標準品，制作目的基因的標準曲線. 檢測各標本Ct值，根據標準曲線計算樣品目的基因的濃度，分別用16S rRNA和1457浮游菌各目的基因表達量進行校準獲得相對表達量. 使用沒有逆轉錄的反應作為對照，鑒別是否有基因組污染. 操作時每份樣品重復3次. RT反應：42℃ 10 min，95℃ 2 min；PCR反應：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，45個循環.

統計學處理：采用Chiss（奇思）2004統計軟件進行組間ttest或t′test，對組內作用前后比較用配對t檢驗進行統計分析.

2結果

2．1總RNA提取

表皮葡萄球菌總RNA提取(圖1). 實時RTPCR標準曲線相關系數為0.997.

2．2基因相對表達量

在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ在膜內菌中的表達均高于浮游菌，且紅霉素作用24 h后的表達高于作用前（P<0.05）；sarA膜內菌的表達高于浮游菌（P<0.05），但紅霉素作用前后的表達無統計學差異（P>0.05）；膜內菌sigB和反應sigB調控活性的基因asp23的表達紅霉素作用前后無統計學差異（P>0.05，表1）.表1實時熒光定量RTPCR檢測表皮葡萄球菌1457不同狀態下基因表達水平（略）

3討論

同金黃色葡萄球菌一樣，全面調節子在表皮葡萄球菌致病性中起著非常重要的作用，主要包括附屬基因調節子agr，附屬調節蛋白sarA和sigB. agr廣泛存在于表皮葡萄球菌中，參與許多毒性因子的調控［4-6］. agr位點包含作用相反的啟動子P2和P3，分別表達RNAⅡ和RNAⅢ 轉錄本. RNAⅡ編碼四個agr介導的毒性因子調節所需的蛋白AgrB， AgrD， AgrC，AgrA，AgrD和AgrB作用產生一種辛肽化合物，即自身誘導肽，參與群體效應調節，當這種辛肽化合物胞外濃度達到閾值時，激活感應器AgrC和調節器 AgrA. 激活的AgrA可上調RNAⅡ和RNAⅢ，RNAⅢ是agr反應的效應器分子，在一定程度上，其表達在細菌對數晚期和靜止期可上調細胞外毒性因子的產生和下調細胞壁表面相關蛋白的轉錄主要作用于轉錄水平，但其如何調節目的基因目前還不十分清楚. RNAⅢ還可編碼產生δ毒素的結構基因［5，7］. 為了解全面調節子agr在表皮葡萄球菌生物膜對紅霉素耐藥性中的作用，我們采用實時熒光RTPCR對表葡1457浮游菌、表葡生物膜紅霉素作用前與作用后agrD， RNA Ⅲ表達進行了檢測，結果顯示在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ膜內菌中的表達均高于浮游菌，且紅霉素作用后的表達高于作用前（P<0.05）；由于agrD的表達與參與群體效應調節的自身誘導肽密切相關［5］，而RNA Ⅲ是agr反應的效應器分子，提示群體效應調節在紅霉素耐藥性增加中起著重要作用. Yao等［8］發現表皮葡萄球菌中agr介導的群體效應的調節是保護細菌逃逸人體防御系統攻擊的主要原因，其調控與抗微生物肽相關的可降解胞外酶和氧化應激反應因子等一系列毒性因子，使細菌盡快適應環境，進而保護細菌在體內生存. 除了agr以外，Xu等［9］首次報道在表皮葡萄球菌存在另一群體效應系統與生物膜的產生相關，生物膜的luxS突變株生物膜的形成增加，且在大鼠模型中生物膜感染加重，雖然參與調控的因子與agr不同，但作用非常相似.

附屬調節蛋白SarA在金葡菌中參與100多個基因的調控，是非常重要的致病因子，表皮葡萄球菌附屬調節蛋白SarA與金葡菌SarA有84%的同源性［7，10］， 由于在表皮葡萄球菌中控制SarA表達的3個啟動子的排列順序與金葡菌不同，因而對于表皮葡萄球菌中SarA所參與致病性的調節作用是否與金葡菌相同目前還在研究之中. 本實驗中膜內菌SarA的表達高于浮游菌，可見SarA的高表達與生物被膜的形成有關，這與Tormo等［10］報道證實SarA是表皮葡萄球菌生物被膜形成中的基本的正調節子，對ica 位點起正調控作用相符. 但紅霉素作用前后SarA的表達無顯著性差異，提示膜內菌紅霉素耐藥性的增加與SarA相關性不顯著.

表皮葡萄球菌中另一個全面調節子sigB是可替換σ因子，其水平及活性隨環境壓力而調節，與金黃色葡萄球菌和枯草桿菌sigB操縱子同源性很高，由4個ORFs (ORF2ORF5)組成，排列為rsbUrsbVrsbWsigB. RsbU為sigB的正調節因子， asp23， coa， clfA， sarH1和sarA 的P3啟動子等一系列毒性相關基因的轉錄后調節與游離的SigB水平相關［11］. 但本實驗結果顯示表葡膜內菌中sigB及其調控活性的基因asp23的表達在紅霉素作用前后沒有顯著性差異，與膜內菌紅霉素耐藥性的增加相關性不顯著.

【

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