作者：胥秀英，鄭一敏，傅善權，韓玉梅，楊艷紅

【摘要】 目的建立重慶道地藥材青蒿高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究方法。方法采用反相高效液相色譜法，測定青蒿藥材指紋圖譜，色譜條件為：色譜柱：Shimadzu C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水梯度洗脫；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：206 nm；柱溫：25℃。結果建立了重慶道地藥材青蒿指紋圖譜標準。結論該指紋圖譜方法簡便、快速、重現性好，可作為青蒿藥材的一項質控指標。

【關鍵詞】 青蒿 指紋圖譜 模糊模式識別 高效液相色譜

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method for identification of Artemisia annua L. from Chongqing. MethodsThe fingerprint was determined by HPLC. The analysis was carried out on Shimadzu C18 column(150 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was CH3OH-H2O（gradient elution）with a flowrate of 1.0 ml·min-1 at 206 nm and the seperation was performed at 25℃．ResultsThe standard of fingerprint in Artemisia annua L was established. Conclusion The method is simple，fast and repeatable. It can be used in quality assessment of Artemisia annua L.

Key words：Artemisia annua L； Fingerprint； Fuzzy pattern recognition； HPLC 青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annua L.的地上部分，味苦、微辛，性寒。具有清熱、解暑作用。用于瘟病、暑熱、骨蒸勞熱、瘧疾、痢疾、瘡癢等［1］。生于曠野、山坡、河岸，分布于全國各地，是重慶道地藥材之一。本實驗利用HPLC法建立了以青蒿素為參照峰的重慶道地藥材指紋圖譜，利用模糊模式識別軟件計算各批藥材相似度，為建立符合規模化生產的青蒿藥材基地提供更多的科學依據。

1 儀器與試藥 Waters液相色譜儀(Waters1525泵、Waters2487紫外檢測器)； SK2200LH超聲儀（昆山市超聲儀器公司）；H·S·G-IIC-4 電熱恒溫水浴鍋（上海儀表供銷公司）；METTLER AE 240 電子分析天平。 甲醇（色譜純）；乙醇（藥用）；其他試劑均為市售分析純；水為純凈水，青蒿素對照品（批號0202-9501，供含量測定用）由中國生物制品檢定所提供。 共收集青蒿藥材樣品15批，均為重慶酉陽栽培品種，經本校傅善權副教授鑒定為黃花蒿Artemisia annua L.的地上部分。 2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備取青蒿素對照品適量，用甲醇溶解制成1.10 mg·ml-1的對照溶液，作為參照物。

2.2 供試品溶液的制備稱取青蒿藥材10 g，加50 ml乙醇回流提取3 h，濾過，再加25 ml乙醇同法處理兩次，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無乙醇，加入相同體積的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，濃縮至干，各取一定量，制成2.5 mg·ml-1的溶液，0.45 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

表1 流動相梯度洗脫程序（略）

圖1 青蒿素參照物與青蒿藥材HPLC圖（略）

2.4 方法學考察與結果

2.4.1 穩定性實驗取“2.2”項供試樣品溶液，在上述色譜條件下，分別于0，2，4，8，16 h進樣10 μl，記錄指紋圖譜。各共有峰的保留時間的RSD為1.08%～2.71%，百分面積RSD為1.15%～2.82%，百分高度RSD為1.13 %～2.94%，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，結果表明樣品溶液在16 h內穩定。

2.4.2 精密度實驗取“2.2”項供試樣品溶液，在上述色譜條件下，連續進樣5次，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰的保留時間的RSD為1.51% ～2.91%，百分面積的RSD為1.94%～2.89%，百分高度的RSD為1.47%～2.98%，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，表明該儀器精密度較好。

2.4.3 重現性實驗 取供試樣品6份，按“2.2”項供試樣品溶液制備方法制得供試樣品溶液。在上述色譜條件下，分別進樣10μl，記錄指紋圖譜。結果表明，各共有峰的保留時間RSD為1.23%～2.82%，百分面積RSD為1.02%～2.78%，百分高度RSD為0.98％～2.97％，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求，表明樣品重復性較好。

2.4.4 青蒿樣品指紋圖譜模式標準的建立分別取10批不同批號的青蒿藥材，按供試品制備方法制備，在上述色譜條件下各進樣10 μl，記錄色譜圖。經比較10批樣品的色譜圖，其中有11個峰為共有指紋峰。選擇相對保留時間、相對峰面積、相對峰高為特征參數，計算各特征參數平均值，建立指紋圖譜模式標準，見表2。

表2 10批青蒿藥材指紋圖譜模式標準（略）

2.4.5 樣品測定與相似度計算取5批樣品， 在相同色譜條件下測定，采用廣義夾角余弦［4］，計算樣品各共有色譜峰與標準模式中對應的色譜峰的相似度。結果各指紋圖譜的相似度均大于0.9，即各批樣品與所建立的模式標準有較好的相似性（見表3）。

3 討論 本實驗對供試品溶液的制備方法、色譜條件進行了篩選。通過對不同提取溶劑、提取方法進行比較，以文中供試品的制備方法，所得指紋圖譜峰數較多。以甲醇-水梯度洗脫分離效果較好，能使樣品中各色譜峰較好地分離且出峰較多。對青蒿素的測定，大多采用衍生化方法，本文采用190～400 nm波長掃描確定其最大吸收波長為206 nm，避免了衍生化方法的繁瑣，使樣品處理更方便、快捷。 采用相對保留時間、相對峰面積、相對峰高等定量表征參數對指紋圖譜進行分析，以10批不同批次藥材制定了青蒿藥材指紋圖譜模式標準。在此基礎上，采用模糊模式識別方法評價5批樣品各共有峰的相似度均大于0.9，符合中藥指紋圖譜研究的技術要求。

表3 5批樣品相似度計算結果（略）

該方法具有穩定、重復性好的特點，是一種理想的指紋圖譜分析方法，可作為青蒿藥材的質控指標。