作者：賈曉東 趙興增 王鳴 郭可躍 趙友誼 馮煦

【摘要】 目的研究茅蒼術的HPLC-ELSD指紋圖譜。方法高效液相色譜法，蒸發光散射檢測器(ELSD)，水（0.25%乙酸）-乙腈梯度洗脫；流速0.6 ml/min；柱溫30℃。ELSD條件：不分流；漂移管溫度112.8℃；空氣流量3.1 L/min。結果共有10個共有峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》得出了茅蒼術藥材的對照指紋圖譜。精密度、穩定性、重復性實驗中各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均<3％。結論 該指紋圖譜方法簡便、重復性好，為有效地控制茅蒼術藥材的內在質量提供了科學依據。

【關鍵詞】 茅蒼術 指紋圖譜 高效液相色譜 蒸發光散射

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea (Thunb.) DC.或北蒼術Atractylodes chinensis (DC.) Koid Z.的干燥根莖［1］。始載于《神農本草經》，蒼術性辛、苦、溫，歸脾、胃、肝經，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目作用。主治脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風濕痹痛、風寒感冒等，中醫臨床使用歷史悠久。其中尤以產于江蘇茅山地區的茅蒼術品質最好。茅山地區是茅蒼術的道地產區。但近年來國際市場對蒼術的需求量日益增加，茅蒼術被掠奪性采挖，加之對茅蒼術生態環境的人為破壞，造成茅蒼術資源的枯竭，使其瀕于滅絕［2］。為了保護這一珍貴資源，需對其優良品質進行分析。查閱相關文獻發現對茅蒼術傳統意義上的活性部位－揮發油的研究，未發現與道地性的直接聯系，所以我們選取了茅蒼術的水溶性部分進行初步的指紋圖譜的研究。由于茅蒼術水溶性部位含有的主要成分為無紫外吸收單萜苷類，故選用蒸發光散射檢測器，獲得了良好而穩定的結果。按照國家藥品監督管理局2000年頒發的“中藥注射劑指紋圖譜技術要求”的有關規定［3］，對產于江蘇茅山地區的不同采集地點的10批茅蒼術進行了HPLC－ELSD指紋圖譜方法的建立。建立其指紋圖譜是為了反映其質量情況，為建立穩定、可靠、全面的質量控制方法提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 樣品本實驗植物樣品包括茅蒼術Atractylodes. lancea (Thunb.) DC.10份，南蒼術2份，北蒼術、白術各1份，其編號、采摘地點及采摘時間等見表1。樣品采收后洗凈切小塊，在55℃下烘干備用。

1.2 對照品蒼術苷A，3，4，11，14-四羥基愈創-9-烯-11-O-β-D-吡喃葡糖苷，純度≥98％，本課題組分得。

1.3 試劑及儀器乙腈：HPLC級；乙酸：AR級；去離子水。Agilent 1100液相色譜儀，HP Chemstation色譜工作站，Alltech ELSD 2000ES蒸發光檢測器，Agilent INTERFACE 35900E 數模轉換器，XWK-Ⅲ無油空氣泵，Phenoxmenex Synergi Hydro-RP 80A柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）加C18預柱。

2 方法

2.1 色譜條件經方法學研究確定色譜條件，流動相A：水（含0.25%乙酸），B：乙腈。梯度洗脫程序見表2。柱溫30℃；流速0.6 ml/min；進樣量：30 μl。ELSD采用不分流模式，漂移管溫度112.8℃，空氣流量：3.1L/min。

表1 植物樣品的采集情況（略）

表2 梯度洗脫程序（略）

2.2 供試液制備取如上干燥植物樣品，粉碎，過40目篩。精密稱定2 g，置索氏提取器中，加80 ml正己烷水浴加熱回流脫脂8 h。棄去正己烷液，取出樣品紙包待正己烷揮發至干，再加80 ml甲醇提取8 h。將甲醇提取液減壓蒸至小體積，甲醇定容至10 ml，用0.45 μm微孔濾膜濾過后備用。

2.3 參照物標準液制備精密稱取蒼術苷A，3，4，11，14-四羥基愈創-9-烯-11-O-β-D-吡喃葡糖苷對照品，甲醇定容配成2.94及1.00 mg/ml的原液備用。

2.4 穩定性實驗取茅蒼術04號樣品供試液，分別在0，4，8，12，24 h檢測指紋圖譜。結果各色譜峰的相對保留時間和峰面積比值基本一致，RSD＜3％，供試品溶液在24 h內穩定，符合指紋圖譜技術要求。

2.5 精密度實驗取茅蒼術03號樣品供試液，連續進樣5次，檢測指紋圖。比較各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，RSD＜3％，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.6 重復性實驗取茅蒼術09號樣品5份，按供試品溶液制備方法制備供試品，檢測指紋圖。并分別按上述液相條件測定，對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行統計，5份供試品溶液的RSD＜3％，符合指紋圖譜的要求。

2.7 樣品測定精密吸取供試品溶液各30 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”中色譜條件測定，記錄色譜圖。以蒼術苷A（S峰）的保留時間及峰面積為1，計算各共有指紋峰的相對保留時間和峰面積比值。并按“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求”建立茅蒼術藥材的指紋圖譜檢測標準。

3 結果

3.1 相對保留值指紋譜的建立采用相對保留時間標定指紋峰，記錄80 min的色譜圖，以圖譜中蒼術苷A（3號峰）為參照物（S），將各指紋峰保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間（設定為1）比較，其比值為各指紋峰的相對保留時間。計算10批藥材指紋圖譜中各指紋峰的技術參數（見表3），標定茅蒼術的特征指紋峰為10個（見圖1）。各特征指紋峰的保留時間為：峰-1（23.432 min）；峰-2（26.383 min）；峰-3（30.468 min）；峰-4（43.478 min）；峰-5（44.682 min）；峰-6（50.365 min）；峰-7（52.176 min）；峰-8（63.336 min）；峰-9（65.065 min）；峰-10（70.435 min）。其中峰6為3，4，11，14-四羥基愈創-9-烯-11-O-β-D-吡喃葡糖苷。

表3 茅蒼術指紋圖譜的技術參數（略）

3.2 共有指紋峰面積的比值通過10批藥材測定，以圖譜中蒼術苷A為參照物（S），將各特征指紋峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積比較，其比值為特征指紋峰的相對峰面積。據“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求”規定，各共有指紋峰的面積比值必須相對固定。峰-4單峰面積占總峰面積百分比＞20％，其差值＜20％；峰-3單峰面積占總峰面積百分比＞10％，而＜20％，其差值＜25％；其余單峰面積比均＜10％，峰面積比值不做要求。符合指紋圖譜的要求。

3.3 非共有峰面積通過10批藥材供試品的測定，統計非共有峰與總峰面積的百分比，其結果為非共有峰面積百分比7.07％，符合指紋圖譜研究的＜10％的檢測要求。

3.4 相似度采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》對各樣品色譜圖的原始文件（輸出格式為aia）進行分析，自動匹配并以10批樣品生成的對照譜圖（中位數法）作為對照模版，計算各色譜圖的整體相似度介于0.564～0.887之間。見表4。

表4 10批藥材相似度（略）

3.5 其它藥材和茅蒼術HPLC-ELSD標準指紋圖譜的比較在同樣條件下分別測定了產于湖北和安徽的南蒼術、北蒼術、白術藥材的色譜圖，并與茅蒼術HPLC-ELSD標準指紋圖譜比較相似度。結果見表5。

圖1 典型茅蒼術HPLC-ELSD色譜圖（略） 4 討論 蒼術為中醫常用藥，臨床應用歷史悠久，具有健脾燥濕、祛風散寒的功效，尤以產于江蘇茅山地區的茅蒼術品質最好，歷來認為茅山是茅蒼術的道地產區。對茅蒼術道地性的研究集中在對其揮發油的研究。大量實驗證明道地產區與非道地產區茅蒼術含油量有顯著性差異，且道地產區低于非道地產區，這提示我們茅蒼術的道地性可能不是體現在揮發油上，而是在水溶性成分中。日本學者在對茅蒼術的研究中，從其水溶性部分分得了大量的單萜苷類成分，且顯示具有較好的藥理活性。基于這種原因，我們對茅蒼術的水溶性化學成分進行了系統的化學分離，并對其指紋圖譜進行研究。實驗發現，蒼術水溶性部分成分多為沒有紫外吸收的單萜苷類成分，采用紫外檢測器在圖譜中基本看不到吸收峰，故本實驗選用ELSD檢測器并獲得了滿意的結果。

表5 與其它藥材的比較結果（略）

4.1 提取條件摸索 比較了甲醇、95％乙醇、50％甲醇、50％乙醇等對樣品的提取效果，以甲醇提取的樣品液出峰較多，故選定甲醇做為提取溶劑。

4.2 液相條件摸索 本實驗采用ELSD檢測方式，ELSD檢測器能檢測到任何揮發性低于流動相的化合物，因此溶劑中極微量的殘留成分也能檢測出來，造成峰的干擾或基線不穩。在液相洗脫條件的摸索中，嘗試了使用甲醇－水，乙腈－水兩種溶劑系統。即使在使用高純度甲醇溶劑時，譜圖中仍有含量較大的雜峰，而在選用乙腈時雜峰較少，故選擇乙腈－水做為梯度洗脫的溶劑系統。茅蒼術所含成分較復雜，給液相分離帶來了很大的困難，通過加入一定的緩沖溶液可以大大的改善峰形，提高分離度。對幾種揮發性的緩沖溶液進行比較，選定加入0.25%的乙酸。 所采集的10批藥材均為野生茅蒼術藥材，生長年限等因素可能會對藥材的內在質量產生一定的影響，所研究的指紋圖譜所表達的信息，僅代表茅蒼術藥材的整體情況，故而10批茅蒼術藥材的指紋圖的相對峰面積值變異較大。 10批茅蒼術藥材圖譜與茅蒼術標準指紋圖譜的相似度介于0.965～0.855之間，產于湖北的南蒼術與茅蒼術標準指紋圖譜的相似度為0.867，顯示兩者有較接近的化學成分組成。產于安徽的南蒼術與茅蒼術標準指紋圖譜的相似度為0.73，明顯不如產于湖北的茅蒼術近，這與其它實驗證明的結論相符。茅蒼術在茅山地區生長具有較好的道地性優勢，引種于湖北地區的茅蒼術道地性優勢優于其它地區。產于北京的北蒼術與茅蒼術標準指紋圖譜的相似度為0.236，顯示二者之間化學成分相差大，不能混用。白術與茅蒼術標準指紋圖譜的相似度為0.062，相似度最低。本實驗建立的HPLC-ELSD指紋圖譜為快速鑒定蒼術類藥材提供了依據。 本實驗在中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）的輔助下，得到了茅蒼術藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜，為茅蒼術藥材的進一步研究及質量控制提供了依據。

【參考文獻】 ［1］ 國家藥典委員會.中國藥典［S］.北京：化學工業出版社，2000：127. ［2］ 賀善安，賀慧生，呂 曄，等．茅蒼術資源的保護和利用［J］.植物資源與環境，1993，2(1)：1. ［3］ 國家藥品監督管理局．中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)［J］.中成藥，2000，22(10)：671.