作者：曹悅，左代英，吳曉蘭，劉敬武，孫啟時

【摘要】 目的建立超高效液相色譜（UPLC）法測定龍膽藥材中活性成分的方法。方法采用L9（34）正交表安排實驗，確定最佳提取條件。色譜柱：Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm， 1.7 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（V∶V = 5.5∶94.5），流速0.80 ml/min；檢測波長235，270 nm；柱溫為40℃。結果獐芽菜苦苷、龍膽苦苷分別在0.154 8～1.858 0 mg/ml，0.322～5.152mg/ml范圍內呈良好的線性關系，平均回收率分別為102.09%，RSD=1.68％（n=6）；103.80%，RSD=1.11％（n=6）。結論采用UPLC法控制龍膽質量，操作簡單，結果準確，方法可行。

【關鍵詞】 龍膽 超高效液相色譜 獐芽菜苦苷 龍膽苦苷

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of swertiamarin and gentiopicroside in root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.MethodsBy L9（34）orthogonal design， an optimal condition was confirmed. The separation was performed on Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm，1.7μm） column， the mobile phase was Acetonitrile-0.1% Phosphorylation（V∶V = 5.5∶94.5）. The flow rate was 0.8 ml/min， the detection wavelength was 235nm， 270nm， and the column temperature was 40℃.ResultsThis method had good linearity in the range of 0.322～5.152mg/ml，and the average recovery was102.09 % with RSD of 1.68%for swertiamarin. It had good linearity in the range of 0.1548～1.858 mg/ml ，and the average recovery was 103.80% with RSD of 1.11%for gentiopicroside.ConclusionThis method is simple ， accurate ， and suitable for the quality control of root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.

Key words：Radix Gentiana Scabra Bge.; UPLC; Swertiamarin; Gentiopicroside 龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag．，龍膽Gentiana scabra Bge．，三花龍膽Gentiana triflora Pall．或堅龍膽Gentiana rigescens Franch．的干燥根及根莖。具有清熱燥濕，瀉肝膽火的作用。用于濕熱黃疸，陰腫陰癢，帶下，強中，濕疹瘙癢，目赤，耳聾，脅痛，口苦，驚風抽搐［1］。龍膽的主要有效成分為環烯醚萜類化合物，有龍膽苦苷（Gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（Swertiamarin）及獐牙菜苷（Sweroside）等，這類物質也是其苦味的物質基礎［2］。目前采用常規液相分析時一般都需要較長的分析時間，而超高效液相色譜(UPLC)技術的應用，是我們在滿足有效分離樣品的同時，極大地縮短了分析時間，有效地提高了工作效率，節約了成本。而本文就是采用UPLC建立了一種快速、準確控制龍膽質量的方法。

1 儀器與試劑 島津-UPLC超高效液相色譜儀，LC-solution色譜工作站。獐芽菜苦苷對照品（北京中西遠大科技有限公司，批號070316 純度99.06%），龍膽苦苷對照品（中國生物制品檢定所，批號110770-200510），磷酸為分析純，其余試劑均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝的考察以獐芽菜苦苷和龍膽苦苷為檢測指標，選取提取溶劑、提取方法、提取時間3個因素，每個因素3個水平，采用L9（34）正交表進行實驗，按“2.4”項制備樣品溶液，按“2.5”項條件進行測定。綜合直觀分析和方差分析的結果，確定最佳提取工藝為：甲醇超聲提取30 min。

2.2 檢測波長的選擇取獐芽菜苦苷和龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成濃度為0.1 mg/ml的溶液，在200～400 nm進行紫外掃描，結果獐芽菜苦苷的最大吸收波長在235 nm，龍膽苦苷的最大吸收波長在270 nm。

2.3 對照品溶液的制備分別精密稱取獐芽菜苦苷和龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成0.15 mg/ml和0.3 mg/ml的溶液。

2.4 供試品溶液的制備取龍膽藥材，粉碎成中粉，取1g置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min（嚴格控制水溫，15 min停1次），冷卻至室溫，以甲醇補足減失的重量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，作為測定獐芽菜苦苷的樣品溶液，精密吸取上述溶液5ml，置25ml量瓶中加甲醇溶液稀釋至刻度，作為測定龍膽苦苷的樣品溶液。

2.5 色譜條件色譜柱Shimadzu C18 （3.0 mm×75 mm， 1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1％磷酸溶液（5.5∶94.5），流速0.8 ml/min，檢測波長分別為235 nm和270 nm，柱溫40℃，進樣量4 μl。

2.6 線性關系分別精密量取獐芽菜苦苷對照品溶液（c=0.154 8mg/ml）1，2，4，6μl、母液（c=0.309 7 mg/ml）4，6μl注入液相色譜儀中，測定峰面積；分別精密量取龍膽苦苷對照品溶液，（c=0.322 mg/ml）1，2，4，8μl、母液（c=0.644 mg/ml）6μl、8μl注入液相色譜儀中，按照“2.5”項的方法測定峰面積，結果表明，獐芽菜苦苷、龍膽苦苷質量濃度（X）在0.154 8～1.858 0 mg/ml和0.322～5.152 mg/ml與峰面積（Y）呈線性關系。回歸方程分別為Y = 889 751X - 9 916.5，r=0.999 8; Y = 805 953X + 25 881， r=0.999 8。

2.7 精密度實驗精密吸取同一供試品溶液4 μl，連續進樣5次，獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的峰面積RSD分別為1.92％，0.32％（n=5）。

2.8 重復性實驗精密稱取龍膽中粉1 g，按“2.4”項制備6份樣品溶液，測定，計算獐芽菜苦苷和龍膽苦苷的含量，其RSD分別為0.79％，2.0％（n=6）。

2.9 穩定性實驗取同一供試品溶液分別在0，2，4，6，8，12，16 h測定，結果表明獐芽菜苦苷和龍膽苦苷在16 h內穩定性良好，峰面積RSD分別為1.65％，0.31％。

2.10 回收率實驗分別精密稱取已知質量分數的龍膽藥材粉末，獐芽菜苦苷0.5 g，龍膽苦苷0.1 g，制備樣品溶液，測定，結果獐芽菜苦苷的平均回收率102.09%，RSD為1.68％（n=6）；龍膽苦苷的平均回收率103.80%，RSD為1.11％（n=6）。

2.11 樣品測定18批樣品系遼寧天瑞綠色產業科技開發有限公司提供的栽培品。取樣品1 g，制備樣品溶液，測定，結果見表1。色譜圖見圖1～4。

表1 樣品測定結果（略）

3 討論 從正交實驗設計法的實驗結果中發現，超聲提取和回流提取兩種方法，在使用甲醇作為溶劑、提取時間為30 min時，所測定的兩個指標性成分的含量基本一致，但考慮到回流的操作相對復雜，而且一旦超出規定的回流時間，兩類成分含量損失較大，分析原因是兩類成分均為裂環烯醚萜苷類化合物，受熱易分解，因此選擇了耐用性較好的超聲提取方法，并且在操作中嚴格控制溫度。 UPLC法用于藥品成分的檢測目前還很少，其優點在于不影響正常分離度的情況下，通過縮小填料粒度、增加線流速的情況下，極大地縮短了分析時間。同常規液相相比，一般能夠縮短4～10倍的分析時間，提高了工作效率。獐芽菜苦苷和龍膽苦苷均為水溶性成分，極性較大，所采用的流動相水的比例很大，采用常規液相需要100 min，而超高液相僅需要20多分鐘，同時滿足了獐芽菜苦苷的有效分離度。 所測定的樣品均為遼寧清原的道地藥材，其龍膽苦苷的含量范圍為56.75～85.61 mg/g，遠高于《中國藥典》［1］規定的10 mg/g的要求。獐牙菜苦苷的含量范圍為3.27～5.52 mg/g，其含量的高低基本與龍膽苦苷的趨勢一致。

圖1 龍膽苦苷的色譜圖（略）

圖2 樣品（1）的色譜圖（略）

圖3 獐牙菜苦苷的色譜圖（略）

圖4 樣品（2）色譜圖（略）

【參考文獻】 ［1］ 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學工業出版社，2005. ［2］ 鄭虎占，董澤宏，佘 靖.中藥現代研究與應用，第2卷［M］.北京:學苑出版社，1997：1398.