【摘要】 目的 研究鬼臼毒素固體脂質納米粒經皮滲透和皮膚貯留情況。方法 采用Franz擴散池測定鬼臼毒素固體脂質納米粒的經皮滲透速率，擴散池與供給池之間為大鼠或家兔腹部皮膚，擴散池面積為2.92 cm2。在體外透皮試驗完結后，取下皮膚，剪碎勻漿，用50%異丙醇生理鹽水提取，提取液處理后用HPLC測定藥物濃度。結果 制得的鬼臼毒素固體脂質納米粒包封率平均為95.28%，RSD為2.53% (n=5)，粒徑在50～200 nm之間。固體脂質納米粒作為載體時，鬼臼毒素經大鼠和家兔離體腹部皮膚的平均滲透速率和累積透過量較市售酊劑明顯降低，同時藥物貯留量較市售酊劑明顯提高。結論 鬼臼毒素固體脂質納米粒具有較強的皮膚靶向性。

【關鍵詞】 鬼臼毒素;固體脂質納米粒;經皮滲透;皮膚貯留

Abstract:Objective To study in vitro transdermal penetration and retention of podophyllotoxin solid lipid nanoparticles(SLN). Methods The in vitro transdermal penetration of podophyllotoxin from SLN was determined by Franz diffusion cells. Between donor compartment and receptor compartment was abdominal skin of rats or rabbits，the avaiable diffusion area of cells was 2.92 cm2. The sample was analyzed by HPLC after treatment. After in vitro transdermal penetration experiment completed，the skin were taken down from cells，cut and homogenated，then extracted with 50% isopropanolnormal saline. The extracting solution was analyzed by HPLC. Results The encapsulation efficiency of obtained podophyllotoxin solid lipid nanoparticles were 95.28% on average，with RSD was 2.53% (n=5) and diameter between 50～200 nm. When solid lipid nanoparticles as deliverer，the average transdermal rate and cumulative transdermal quantity of podophyllotoxin through rat and rabbit abdominal skin in vitro were significantly lower than marketed tincture，while skin retention quantity of podophyllotoxin in rat and rabbit abdominal skin were significantly higher than marketed tincture. Conclusion Podophyllotoxin SLN had higher local concentration of drug in skin.

Key words:podophyllotoxin; solid lipid nanoparticles; skin penetration; skin retention

鬼臼毒素(podophyllotoxin，POD)亦名足葉草毒素，為小蘗科桃兒七根莖部提取的有效成分，體外藥效試驗證明能抑制培養的正常人皮膚角質形成細胞和宮頸癌上皮細胞的脫氧核苷摻入和DNA合成，阻礙其分裂和增殖[1]。以鬼臼毒素為主藥的制劑在臨床已應用多年，其治療作用已得到肯定。目前臨床上廣泛使用0.5%鬼臼毒素酊劑治療尖銳濕疣，多發性淺表性上皮瘤病(如多發性淺表性或浸潤性基底細胞上皮瘤，鱗狀細胞上皮瘤和基底鱗狀細胞上皮瘤)，前上皮瘤性角化病，脂溢性角化、日光性角化和射線角化病，幼年喉頭乳頭瘤、疣(尋常疣、絲狀疣)等疾病[2-4]。但鬼臼毒素酊劑大面積使用時易產生吸收毒性，因此限制了其使用范圍。固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)是以固態的天然或合成的脂類如硬脂酸、磷脂、三酰甘油、長飽和脂肪酸等作為藥物載體，將藥物包裹或夾嵌于類脂核中制成粒徑約為50～1 000 nm的粒子，具有體積小、脂溶性大、皮膚靶向性較強[5-6]等優點。以固體脂質納米粒作為鬼臼毒素載體的研究在國內開展得較多，但在制備過程中均使用了二氯甲烷等有機溶劑，而且對皮膚貯留情況的研究較少[7-10]。本研究采用微乳法制備鬼臼毒素固體脂質納米粒，避免了有機溶劑的使用，并對其經皮吸收和皮膚貯留情況進行較系統的研究。

1 儀器與試藥

LC20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);C18反相硅膠色譜柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm，迪瑪科技); TK12B型透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿易有限公司); FA2004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司);0MODEL5000型微量移液器(NICHIRYO，日本);HD931型紫外在線檢測儀(上海金達生化儀器有限公司);JEM100CXⅡ型電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

鬼臼毒素(福建華海藥業有限公司，質量分數 99.5%，批號080901);鬼臼毒素對照品(中國藥品生物制品檢定所，質量分數99.9%，批號111645200501);0.5%鬼臼毒素酊劑(福建華海藥業有限公司，批號081202);0.5%鬼臼毒素固體脂質納米粒(自制);單硬脂酸甘油酯(國藥集團化學試劑有限公司，批號 F20060412);吐溫80(廣州化學試劑廠，批號200707011);聚乙二醇400(國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071210);2，6二叔丁基對甲酚(國藥集團化學試劑有限公司，批號F20071101);Sephadex G50葡聚糖(ICN Biomedicals Inc.，批號94445);甲醇為色譜純;其余試劑除均為分析純。

大鼠(SD，200～250 g，證號2008A001)、家兔(雄性，2.2 kg，證號2008A020)均購自廣東省醫學實驗動物中心。

2 方法與結果

2.1 固體脂質納米粒的制備及包封率測定

根據文獻[11]改進制備處方和工藝：取單硬脂酸甘油酯 3.0 g、吐溫80 4.0 g、聚乙二醇400 5.0 g、2，6二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene，BHT) 0.04 g，置70 ℃水浴使其完全熔融形成溶液;然后在200 r·min-1攪拌、70 ℃下加入鬼臼毒素0.5 g，繼續攪拌直至形成澄清透明溶液;然后加入10 mL、70 ℃的水，于200 r·min-1攪拌20 min，形成穩定均一的納米乳;將納米乳迅速倒入以1 000 r·min-1攪拌的80 mL、2 ℃的水中，攪拌5 min后轉速調至200 r·min-1，攪拌3 h，即得。

同法制備不含鬼臼毒素空白固體脂質納米粒。

鬼臼毒素固體脂質納米粒的混懸液略帶銀白色乳光，其微觀形態見圖1。從圖1可見，鬼臼毒素固體脂質納米粒為圓形實心小顆粒，粒徑在50～200 nm之間。

采用凝膠柱層析法測定上述制品的包封率，常法裝Sephadex G50凝膠柱(1.5 cm×30 cm)，取空白脂質納米粒1 mL上柱，以水洗脫，飽和柱子;再分別精密吸取載藥脂質納米粒混懸液0.2、0.3、0.5、1 mL上柱，以水洗脫，流速1.0 mL·min-1，在線檢測紫外吸收。結果表明，載藥脂質納米粒混懸液上樣量為0.2 mL時，凝膠柱可將含藥脂質體和游離藥物完全分離，柱加樣回收率平均為99.32%，RSD為1.64%(n=5)。精密移取鬼臼毒素固體脂質納米粒混懸液0.2 mL上柱，以水洗脫，分段收集后，測定游離藥物的量，按 (m總-m游離)/m總×100%(m總：總藥物量，m游離：未包入納米粒的游離藥物量)計算包封率，結果制品包封率平均為95.28%，RSD為2.53%(n=5)。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相為甲醇水冰醋酸(體積比59∶41∶0.6)[9]， 檢測波長為292 nm， 流速為

1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。

精密稱取10.0 mg鬼臼毒素對照品，置50 mL量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm濾膜過濾，取續濾液進樣分析，記錄色譜圖如圖2。

各取空白固體脂質納米粒混懸液和載藥固體脂質納米粒混懸液0.1 g，置25 mL量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm濾膜過濾，取續濾液進樣分析，記錄色譜圖如圖3。由圖可見，輔料在該色譜條件下對主藥的測定沒有干擾。

將動物皮膚夾在透皮擴散試驗儀供給池與接受池之間(擴散池面積2.92 cm2)，在供給池一側加入1 mL接受液，接受池含有7 mL接受液與攪拌子(攪拌轉速500 r·min-1)，32 ℃恒溫攪拌，于24 h取接受液0.5 mL， 0.45μm微孔濾膜過濾后取續濾液，按上述HPLC條件測定，記錄色譜圖如圖4。從圖4可見，空白皮膚在該色譜條件下對鬼臼毒素的測定沒有干擾。

2.2.2 標準曲線 分別配制質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg·mL-1的鬼臼毒素的系列對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液注入HPLC儀，以峰面積(A)對質量濃度(ρ)進行線性回歸，得鬼臼毒素線性回歸方程：A=9914.7ρ-5690.1， R2=0.999 8。

2.2.3 精密度及回收率試驗 鬼臼毒素低、中、高(5.0、20.0、40.0 μg·mL-1)3 種濃度的樣品的日內及日間RSD分別為1.05%、0.71%、0.63%(n=5)及1.44%、0.91%、0.95%(n=5);回收率分別為100.16%、99.86%、100.03%，RSD分別為0.96%、0.65%、0.76%(n=5)。