作者：徐歡 董斌 林月霞，田素娟 杜欣娥

【摘要】 目的 利用檸檬酸三鈉作為還原劑，制備顆粒均一、分布均勻的納米膠體金。方法 通過考察反應時間、攪拌速度以及初始沸騰時間3個因素來確定最佳的制備條件，以紫外吸收峰、粒徑及透射電鏡掃描結果進行綜合評價。結果 膠體金溶液的最佳制備條件為：在200 r/min的攪拌速度加熱至沸騰，沸騰后立即加入還原劑，反應12 min后停止攪拌;所制得的膠體金的粒徑為20 nm左右。 結論 采用優化條件所制得的膠體金顆粒均一、分布均勻。

【關鍵詞】 膠體金;納米粒;制備方法;優化條件

Abstract:Objective To prepare the homogeneous particles and uniformly distributed colloidal gold nanoparticles with sodium citrate as reducing agent.Methods The optimum preparation conditions were screened by changing the reaction time，stirring speed and initial boiling time，and UV spectrophotometer，particle size distribution apparatus，as well as transmission electron microscopy (TEM) were comprehensively evaluated.Results Colloidal gold of about 20 nm particle size were prepared in conditions of being heated to boiling and added the reducing agent immediately at the stirring speed of 200 r/min of 12 min.Conclusion Homogeneous particles and uniformly distributed colloidal gold nanoparticles can be obtained in the optimum conditions.

Key words:colloidal gold; nanoparticle; preparative method; optimum conditions

膠體金免疫層析法是20世紀90年代在美國興起的一種基于免疫膠體金技術的快速診斷技術，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1～150 nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。1971年Faulk和Taylor將膠體金引入免疫化學中[1]，開始作為一種免疫標記技術使用，膠體金在免疫化學中的這種應用，又被稱為免疫金，近年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技術[2～3]。

膠體金的制備方法一般采用還原法，常見的有硼氫化鈉還原法(2 nm)、白磷還原法(5 nm)、抗壞血酸還原法(8～12 nm)、檸檬酸鞣酸還原法(3～15 nm)、檸檬酸三鈉還原法[4] (10～150 nm)，其中檸檬酸三鈉法是最經典的方法，其基本原理是向一定濃度的金溶液內加入一定量的檸檬酸三鈉使金離子還原變成金原子，其工藝簡單，成本低廉，但在實際應用過程中很容易出現顆粒聚集、重復性差等問題，影響膠體金在免疫分析中的應用[5]。據文獻報道，保持檸檬酸三鈉和氯金酸的摩爾比恒定可初步控制膠體金的粒徑范圍[6]，但是顆粒的均勻度和分散度卻與加熱條件及加熱時間有密切關系。

本文采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，對影響氯金酸和檸檬酸三鈉水溶液反應的幾種因素進行優化，選擇出最佳的反應時間、沸騰時間以及攪拌速度，并通過紫外吸收峰、透射電鏡結果及粒徑對所制備的膠體金溶液進行綜合評價，為制備膠體金免疫層析檢測試紙奠定基礎。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

氯金酸(Sigma公司原裝進口)、檸檬酸三鈉(國藥集團化學試劑有限公司)等均為分析純，使用前未經進一步純化。實驗用水均為經超純水裝置凈化的二次去離子水，電阻率>18 MΩ·cm。

1.2 儀器

JJ2000B分析天平[佛蘭德(北京)電子有限公司]，SXJQ1型數顯直流無級調速攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)，TC15型恒溫加熱套(海寧市華星儀器廠)，Spectronic 1.70紫外可見光分光光度儀(廈門聯信誠有限公司)，JEM1400透射電鏡[日本電子株式會社(JEOL)]，Nano Series NanoZS90型粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)。

2 膠體金溶液的制備

2.1 器皿的硅化

將所用器皿用酸液浸泡72 h，取出，大量自來水沖洗，蒸餾水浸泡24 h，干燥，用含5%的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，硅化完成后用雙蒸水沖洗多次，烘干。

2.2 檸檬酸三鈉還原法制備膠體金

取質量濃度0.01%氯金酸水溶液100 mL加熱至沸，攪拌下加入預熱的質量濃度1%檸檬酸三鈉水溶液4 mL，金黃色的氯金酸水溶液在2 min內變為灰色，然后由灰色變為酒紅色，繼續攪拌煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻后用雙蒸水定容至100 mL，4 ℃冰箱中避光保存。

2.3 制備膠體金條件的優化

分別在200、250、300 r/min的攪拌速度下，氯金酸水溶液煮沸0、2 min，加入檸檬酸三鈉水溶液，煮沸反應10、12 min，制得膠體金溶液，然后進行質量鑒定。

2.4 膠體金的質量鑒定

2.4.1 肉眼觀察

觀察其顏色、均勻度和透明度。

2.4.2 可見光掃描鑒定

將冷卻后的膠體金溶液在400～600 nm進行掃描，確定最大吸收峰波長，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。

2.4.3 粒徑分布情況

對膠體金顆粒從數量粒度分布、體積粒度分布、強度粒度分布等因素對膠體金的粒徑分布情況進行測定分析。

2.4.4 透射電鏡觀察

透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小、均勻度、有無橢圓形及多角形、有無顆粒的聚集情況。

3 結果

3.1 制備條件的選取

氯金酸反應液在加熱過程中的顏色變化時間隨溶液起始沸騰時間和攪拌轉速的不同而不同，隨著加熱時間的延長，溶液顏色變化過程為淺黃色→灰色→淺藍色→紫紅色→橘紅色。本實驗利用螺旋攪拌器轉速的可控性以及加熱套溫度的可調性，通過改變反應過程中的攪拌速度和氯金酸溶液的初始沸騰時間以及加入還原劑后的反應時間，選取9種不同方案的制備條件，見表1。表1 制備膠體金的反應條件

3.2 膠體金質量評價

3.2.1 紫外掃描鑒定

膠體金溶液在可見光400～600 nm的掃描圖譜見圖1。從圖1可見：膠體金的最大吸收峰在520～530 nm范圍內，主峰寬度較小，說明膠體金溶液的粒徑分布較均勻;9個實驗樣品中，7、8、9號的可見光吸收光譜的最大吸收峰明顯向長波方向紅移，其他6個樣品的分散狀態良好;初步推斷攪拌速度的大小對膠體金溶液的分散狀態有明顯的決定作用。

1-9.不同條件制備的9個實驗樣品

圖1 膠體金的可見光(400～600 nm)吸收光譜

Figure 1 Visible spectrum(400～600 nm)of colloidal gold

3.2.2 透射電鏡掃描結果

膠體金電鏡觀察結果如圖2所示。從圖可見：樣品1形狀規則，粒徑均勻，平均粒徑為22 nm;樣品2雖然形狀規則，但有一定程度的聚集現象;而樣品4與前兩種樣品的形狀規則度與聚集情況相比，均有一定的差異。電鏡結果與可見光吸收光譜的結果一致，說明攪拌速度越大，樣品越容易發生聚集。

3.2.3 粒徑測定結果

由可見光掃描結果與電鏡掃描結果中選出峰形較優、顆粒較規則的膠體金的制備條件，見表2。表2 膠體金的優化制備條件

將以上樣品利用粒徑測定儀從數量粒度分布、體積粒度分布、強度粒度分布進行分析，以對分布性最靈敏的強度粒度分布為指標(見圖3-5)，選出膠體金顆粒均一性(單分散系)最好的制備條件。

Figure 5 The size distribution by intensity of sample 4 從圖3-5可見，樣品1與其他兩種條件下制備的膠體金溶液進行對比，具有良好的均一性，其平均粒徑為22.7 nm，多分散指數(PDI)為0.201(PDI表示體系中粒徑的分散程度，數值越小表示體系中的顆粒粒度分布越集中)，表明還原劑的加入時間對溶液的分布情況也有一定的影響。

綜上分析，經過可見光吸收光譜和透射電鏡以及粒徑分布掃描的判斷，選擇本實驗膠體金制備的最佳條件為：0.01%氯金酸水溶液100 mL在200 r/min的攪拌速度加熱至沸，沸騰后立即加入還原劑，反應12 min后停止攪拌，室溫冷卻，并定容至100 mL。

3 討論

膠體金的質量受還原劑的用量、反應時間、攪拌速度等因素的影響[7]。本實驗研究證明攪拌速度是影響膠體金制備的主要因素，其次是沸騰時間和加入檸檬酸三鈉后的反應時間。還原劑檸檬酸三鈉要一次迅速加入，不要多次加入。攪拌不均勻、攪拌速度太慢等，易造成顆粒大小不等[8]。膠體金應放在4 ℃保存，避免低溫凍存，因為凍存可導致膠體金凝聚，破壞膠體狀態，膠體金可在4 ℃保存6個月左右[9]。由于膠體金的不穩定性和聚沉的可能性，膠體金溶液宜盡快進行標記。

本實驗利用調速攪拌器和加熱套作為攪拌和加熱裝置，大大改善了磁力攪拌器在攪拌過程中出現的漩渦現象以及局部受熱不均勻的情況，從而在攪拌速度合理的前提下，在反應起始快速攪拌混勻反應物，隨后慢速攪拌，這樣能很好地改善形成湍流的情況，從而制備出的顆粒均勻膠體金顆粒。

本實驗通過控制還原劑的量分別制備了15 nm和22 nm兩種粒徑的膠體金顆粒，所加入檸檬酸三鈉的量分別為4 mL和2 mL，但制備結果顯示粒徑為15 nm的膠體金平均粒徑在18～20 nm，粒徑為22 nm的平均粒徑為24～26 nm左右，顯示膠體金的粒徑雖與還原劑的加入量有關，但是人為操作的誤差對粒徑大小也有一定的改變，制備過程中不能完全按照還原劑比例的多少來確定粒徑，否則對標記會有很大影響。

本實驗在衡量膠體金質量的過程中增加了粒度分布情況這一指標，從而在電鏡鑒定顆粒形狀的基礎上，能更好地對膠體金溶液的分布情況進行評價，制備出質量更優良的膠體金溶液，為膠體金免疫層析檢測提供了切實有效的標記材料。