作者：李園，陳桐楷，林華慶，張蜀，鄧紅

【摘要】 目的 建立石杉堿甲固體脂質(zhì)納米粒(Hup ASLN)包封率的測定方法。方法 分別采用透析法、超濾法分離固體脂質(zhì)納米粒和游離藥物，以高效液相色譜法測定石杉堿甲的含量。結(jié)果 超濾法能有效地將石杉堿甲固體脂質(zhì)納米粒與游離石杉堿甲分離，回收率為98.09%，測得3批樣品的平均包封率為57.63%。結(jié)論 超濾法方便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于石杉堿甲固體脂質(zhì)納米粒的包封率測定。

【關(guān)鍵詞】 石杉堿甲;固體脂質(zhì)納米粒;包封率;透析法;超濾法

Abstract:Objective To establish a method for the determination of the entrapment efficiency of solid lipid nanoparticles loading huperzine A (Hup ASLN). Methods The solid lipid nanoparticles and free drugs were separated by ultrafiltration and dialysis with HPLC for the assay of Hup A. Results Free drugs could be effectively separated from the Hup ASLN by ultrafiltration. The average entrapment efficiency of three batches of Hup ASLN was 57.63%，with the recovery of 98.09%.Conclusion It convenient，sensitive and accurate with ultrafiltration，and can be used to determine the entrapment efficiency of Hup ASLN.

Key words:huperzine A; solid lipid nanoparticles; entrapment efficiency; dialysis; ultrafiltration

石杉堿甲(huperzine A，Hup A)是從中草藥蛇足石杉(千層塔)中分離出來的天然產(chǎn)物，是一種高效、可逆的膽堿酯酶抑制劑，能促進(jìn)記憶再現(xiàn)和增強(qiáng)記憶保持。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，石杉堿甲治療阿爾茨海默氏病有確切的臨床療效，是目前國際上治療老年癡呆較為理想的候選藥物[1]。但石杉堿甲生物半衰期短，口服或注射后會出現(xiàn)不良反應(yīng)而影響其療效[2]。近年來，固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)作為一種給藥新載體，在不同給藥途徑中具有很大的開發(fā)潛力和市場前景。將Hup A包封于SLN內(nèi)，再制成經(jīng)皮給藥制劑，能增加藥物在局部組織的積累并起到持續(xù)釋藥的作用，相對減少全身吸收以避免不良反應(yīng)。

SLN的藥物包封率是處方工藝篩選與質(zhì)量評價(jià)的重要指標(biāo)，也是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵。本文采用高壓乳勻法制備了石杉堿甲固體脂質(zhì)納米粒(Hup ASLN)，分別用透析法、超濾法測定其包封率，并分別對這兩種測定方法進(jìn)行比較和方法學(xué)考察，優(yōu)選出準(zhǔn)確度高的Hup ASLN包封率測定方法。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000型液相色譜儀(美國戴安公司);NS1001L型高壓均質(zhì)機(jī)(意大利Niro Soavi SPA. 公司);Zetasizer 3000HS 型激光粒度儀(英國Malvern公司)。

石杉堿甲原料藥(浙江萬邦藥業(yè)有限公司，批號:20090402);透析袋(截留分子量8 000～13 000，上海百博有限公司);單硬脂酸甘油酯(天津市百世化工有限公司);超濾離心管(截留分子量50 000，Sartorius);泊洛沙姆188(德國BASF公司);油酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠);甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Hup ASLN的制備[3，4]

稱取1.5 g泊洛沙姆188，加適量蒸餾水超聲分散至完全溶解，將其置于70 ℃恒溫水浴中，作為水相;稱取處方量的主藥與混合脂質(zhì)材料(單硬脂酸甘油酯和油酸)，主藥和脂質(zhì)材料比例為1∶30(質(zhì)量比)，在恒溫磁力攪拌器70 ℃條件下充分熔融，作為油相。在磁力攪拌下(1 000 r·min-1)，將水相滴加到油相中，保持恒溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間后停止加熱，并繼續(xù)攪拌一定時(shí)間，得初乳。將初乳在均質(zhì)壓力70 000～90 000 kPa下，通過高壓均質(zhì)機(jī)乳勻4次，即得Hup ASLN。同法制備3批，置于4 ℃冰箱保存，備用。同法制備空白SLN。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C8 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相：0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀(pH值3.90)乙腈 (體積比86∶14);進(jìn)樣量：20 μL;檢測波長：310 nm;流速：0.8 mL·min-1。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取空白固體脂質(zhì)納米粒及含藥固體脂質(zhì)納米粒各1 mL，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液超聲破乳后定容至50 mL容量瓶中，離心，取上清液過濾，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。由圖1可見，石杉堿甲峰與相鄰峰分離良好，保留時(shí)間約為6.3 min，輔料對藥物的測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取石杉堿甲對照品，用體積分?jǐn)?shù)20%的甲醇溶液溶解后配成質(zhì)量濃度為500.0 μg·mL-1的儲備液。分別精密移取儲備液適量，用體積分?jǐn)?shù)20%甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5.0、10.0、25.0、40.0、50.0 μg·mL-1的系列對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(ρ)作線性回歸，得回歸方程為A=0.794ρ-0.1225 (r=0.999 9)，表明石杉堿甲在5.0～50.0 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下5.0、25.0、50.0 μg·mL-1的溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，于1 d各重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度，結(jié)果低、中、高3種濃度的RSD分別為0.28%、0.03%、0.07%;連續(xù)5 d重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日間精密度，RSD分別為0.43%、0.11%、0.19%。表明精密度符合方法學(xué)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“專屬性試驗(yàn)”項(xiàng)下的含藥供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果RSD為0.56%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密配制低、中、高3個(gè)濃度(相當(dāng)于Hup A質(zhì)量濃度為400.0、500.0、600.0 μg·mL-1)的Hup A 20%甲醇溶液，分別與空白SLN按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各1 mL，每個(gè)濃度各5份，分別置10 mL容量瓶中，加適量體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液超聲20 min后定容，然后經(jīng)3 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，取上清液過濾后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.8 Hup ASLN中Hup A含量的測定

精密移取Hup ASLN 1 mL，置50 mL容量瓶中，加適量體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液超聲20 min后定容，然后經(jīng)3 000 r·min-1離心機(jī)離心10 min，取上清液過濾后按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，用外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。測得3批樣品的含量分別為99.53%、99.78%、99.81%。表1 回收率試驗(yàn)

2.9 Hup ASLN包封率的測定

2.9.1 透析法

2.9.1.1 透析介質(zhì)的選擇

透析法中透析介質(zhì)一般以水為主體，因Hup A不溶于水，易溶于甲醇，故選擇透析介質(zhì)時(shí)考慮使用不同濃度的甲醇水溶液。因甲醇對SLN的結(jié)構(gòu)有破壞作用，故避免使用高濃度甲醇。預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)20%的甲醇水溶液對Hup A有一定的溶解能力，可以滿足藥物游離出來的條件。且該體積分?jǐn)?shù)的甲醇對SLN的外觀與結(jié)構(gòu)無明顯影響，不會破壞粒子的乳化層而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。故選擇20%的甲醇水溶液作為透析介質(zhì)。

2.9.1.2 透析條件的確定[5]

精密移取Hup ASLN 1 mL，置已處理好的透析袋中，兩端扎緊后作為內(nèi)相，再移取20%的甲醇水溶液10 mL作為透析介質(zhì)，同法做8份樣品。在25 ℃、120 r·min-1條件下，將樣品置于搖床中，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、5、6 h時(shí)間點(diǎn)各取出1份樣品，取透析介質(zhì)過濾后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算其中游離藥物含量，結(jié)果表明在2 h后達(dá)到透析平衡。

2.9.1.3 方法回收率試驗(yàn)

配制低、中、高3個(gè)濃度(分別相當(dāng)于Hup A質(zhì)量濃度為400.0、500.0、600.0 μg·mL-1)的Hup A 20%甲醇溶液，分別與空白SLN按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各1 mL，在25 ℃、120 r·min-1條件下，將其置于搖床中平衡2 h，取透析外相過濾后，測定游離藥物含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.9.1.4 包封率的測定

精密移取Hup ASLN 1 mL，置已處理好的透析袋中，兩端扎緊后作為內(nèi)相，再移取20%的甲醇水溶液10 mL作為透析介質(zhì)。25 ℃、120 r·min-1條件下，置于搖床中，透析2 h，然后取透析介質(zhì)過濾，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算其中游離藥物的量(Wf);同時(shí)精密移取Hup ASLN 1 mL，同“2.8”項(xiàng)下測定Hup ASLN中總藥物的含量，計(jì)算總藥物的量(Wo)，并計(jì)算包封率[包封率=(Wo-Wf)/Wo×100%]。用上述方法平行測定3批樣品的包封率為54.24%、52.08%、53.83%，平均值為53.38%。

2.9.2 超濾法

2.9.2.1 超濾離心管對SLN透過能力的考察

取Hup ASLN適量置超濾離心管中離心30 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，收集濾液并測定粒徑。濾液中未檢測到SLN，表明濾液中無SLN存在，超濾離心管能達(dá)到完全截留SLN的效果。

2.9.2.2 方法回收率試驗(yàn)[6]

配制低、中、高3個(gè)濃度(相當(dāng)于Hup A質(zhì)量濃度為400.0、500.0、600.0 μg·mL-1)的Hup A 20%甲醇溶液，分別與空白SLN按1∶1比例混合得到混合溶液。精密移取上述混合溶液各2 mL置超濾離心管中離心30 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)20%甲醇稀釋定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。表2 方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9.2.3 包封率的測定

取Hup ASLN適量，置超濾離心管中離心30 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，取續(xù)濾液1 mL置10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)20%甲醇稀釋定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算其中游離藥物的量(Wf);同時(shí)移取精密Hup ASLN 1 mL，同“2.8”項(xiàng)下測定Hup ASLN中總藥物的含量，計(jì)算總藥物的量(Wo)，并計(jì)算包封率[包封率=(Wo-Wf)/Wo×100%]。測得3批樣品的包封率為58.42%、56.36%、58.11%，平均值為57.63%。

3 討論

3.1 測定SLN包封率的方法有多種，如葡聚糖凝膠柱法、魚精蛋白沉淀法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等，其原理都是采用一定的方法使包封的藥物和游離藥物分離，測定包封或游離藥物的濃度，計(jì)算包封率[7，8]。由于本實(shí)驗(yàn)所制備的SLN粒徑較小(30～100 nm)，冷凍超速離心(20 000×g)2 h仍未見分層，故該法不適合于Hup ASLN包封率的測定。本文也曾嘗試葡聚糖凝膠柱法分離Hup ASLN中的游離藥物，試驗(yàn)中采用蒸餾水作為洗脫劑時(shí)，游離藥物的回收率僅為70%左右，可能是Hup A易吸附在葡聚糖凝膠表面，蒸餾水對Hup A溶解能力較小，難以洗脫下來;改用對Hup A溶解能力較大的甲醇水溶液洗脫時(shí)，雖然Hup A的回收率接近95%，但葡聚糖凝膠的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，洗脫過程中葡聚糖凝膠逐漸塌陷。

3.2 本實(shí)驗(yàn)包封率測定結(jié)果表明超濾法測得的包封率較透析法高，原因可能是透析法的測定過程所用的時(shí)間較長，在透析過程中被包封藥物可能有部分泄漏。超濾法是在離心力的作用下，利用篩分原理對大分子和小分子物質(zhì)進(jìn)行分離：溶劑與部分相對分子質(zhì)量小的溶質(zhì)穿過超濾膜的孔道到達(dá)膜的另一側(cè)，而相對分子質(zhì)量大的溶質(zhì)或納米粒被截留，由于操作時(shí)間短，而且樣品不必進(jìn)行稀釋，不存在被包封藥物泄漏的問題。另外，從回收率試驗(yàn)結(jié)果可以看出，透析法仍然存在游離藥物回收率低的問題，其準(zhǔn)確度較低。超濾法操作簡單、快速、重現(xiàn)性好，適用于石杉堿甲固體脂質(zhì)納米粒的包封率測定。