作者：馬鵬， 徐成振， 徐曉峰， 陳靜， 龔愛華， 張志堅

【摘要】 目的： 探索纖維蛋白(fibrin，FB)修飾的納米晶膠原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen，nHAC)支架材料上成骨誘導的骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells， MSCs)黏附、增殖及分化的情況。方法： 實驗分為兩組：實驗組，纖維蛋白修飾的納米晶膠原基骨(FBnHAC)；對照組，單純的納米晶膠原基骨(nHAC)。將SD大鼠骨髓間充質干細胞定向誘導為成骨細胞，種植于支架材料上，體外復合培養。通過檢測支架材料的細胞黏附率、不同時間點(3，7，10，14 d)支架材料中細胞數、堿性磷酸酶表達量以及掃描電鏡觀察細胞在支架材料上的生長狀況，比較分析不同支架材料與細胞生物相容性差異。結果： 大鼠MSCs經誘導培養14 d后，I型膠原免疫熒光染色為陽性；實驗組支架材料的細胞黏附率顯著高于對照組(P<0.05)；且相同時間點實驗組支架材料中的細胞數及堿性磷酸酶表達量也明顯高于對照組(P<0.05)；電鏡觀察發現兩組材料上均有細胞生長，但實驗組的細胞生長狀況明顯好于對照組。結論： 表面修飾纖維蛋白后的nHAC支架材料具有更好的細胞黏附、增殖及促成骨分化能力。

【關鍵詞】 纖維蛋白； 修飾； 納米晶膠原基骨； 組織工程骨

［Abstract］ Objective: NanoHydroxyapatite/collagen(nHAC) modified with fibrin was prepared， and the adhesion， proliferation and differentiation of marrow mesenchymal stem cells on the scaffolds were investigated.Methods： MSCs obtained from SD rat bone marrow were induced and proliferated. After their osteoblastic phenotypes were demonstrated， MSCs were seeded onto nHAC modified with fibrin(experiment group) and common nHAC(control group). The adhesive rates were calculated respectively. At different time points(3， 7， 10，14 d)， the number of the cells in the scaffolds was counted and alkaline phosphatase(ALP) activity was detected. The cells growth on scaffolds also was observed by scanning electron micrograph(SEM).The differences between groups were compared and analyzed. Results： The differentiation of MSCs to osteoblastic phenotype were demonstrated by the positive staining of collagen type I. The efficiency of cell adhesion in the modified nHAC was higher than the unmodified nHAC(P<0.05). The cell number and ALP activity of MSCs adhered to nHAC modified by fibrin were obviously higher than that of MSCs adhered to simple material(P<0.05). Cells could be observed on every scaffold by SEM， but cells on the modified nHAC grew obviously better than that on the unmodified nHAC. Conclusion： nHAC modified with fibrin had a better cell adhesion， proliferation and facilitate bone formation ability.

［Key words］ fibrin; modification; nanoHydroxyapatite/collagen; tissue engineered bone

嚴重創傷、炎癥、腫瘤、先天性畸形等導致的節段性骨缺損是骨科醫師面臨的臨床難題之一。利用組織工程技術構建組織工程骨治療骨缺損是具有臨床應用價值的治療策略，其中支架材料是構建組織工程骨的關鍵要素之一，理想的支架材料應有利于種子細胞的黏附、增殖及分化，并在體內能形成生物活性組織。納米晶膠原基骨（nanoHydroxyapatite/collagen，nHAC）已經作為人工合成生物支架材料替代骨缺損應用于臨床［1］，研究表明其復合細胞后具有體內成骨能力［2］。為了進一步提高nHAC的細胞相容性，本研究充分利用纖維蛋白（fibrin，FB）的生物學特性，對nHAC進行表面修飾處理，以促進成骨誘導的骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在nHAC上的黏附、增殖及分化，為骨組織工程提供一種支架材料的表面修飾手段。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑 健康雄性SD大鼠，體質量約100 g，由江蘇大學動物實驗中心提供；納米晶膠原基骨，由清華大學材料系提供；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；地塞米松、維生素C、β甘油磷酸鈉、纖維蛋白原、Cy3標記的羊抗小鼠IgG、hoechst33342（Sigma公司）；小鼠抗大鼠I型膠原單克隆抗體(Santa Cruz公司)；新鮮血漿自制；堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方 法

1.2.1 SD大鼠MSCs的獲得與成骨誘導 頸椎脫臼處死大鼠，無菌條件下取其股骨、脛骨， 用含體積分數10%胎牛血清的LDMEM 培養液沖洗骨髓腔以沖出骨髓，淋巴細胞分離液分離后，置入含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、 10 mmol/L β甘油磷酸鈉的LDMEM培養基中，37℃、5%CO2 孵箱中培養，3～4 d后首次半量換液，去除不貼壁細胞，以后每2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長分化情況。

1.2.2 FBnHAC支架材料的制備 將纖維蛋白原(fibrinogen，FG)(w/v，10%)溶于LDMEM中，nHAC切割成5 mm×5 mm×5 mm大小，置于FG/LDMEM中4℃過夜，處理24 h，取出后浸泡于新鮮的大鼠血漿中，迅速取出置于24孔培養板中備用。

1.2.3 I型膠原免疫熒光染色 大鼠MSCs經誘導培養14 d后，吸去培養基，固定細胞，PBS洗滌0.25%TrixonX100 37℃水浴1 h，3%牛血清白蛋白封閉，加小鼠抗大鼠I型膠原單克隆抗體（1∶100），4℃ 24 h，再37℃水浴4 h，PBS洗滌，滴加Cy3紅色熒光標記的羊抗小鼠IgG（1∶300），37℃水浴1 h，PBS洗滌，加hoechst33342，室溫5 min，PBS洗滌，甘油封固，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 構建組織工程骨 0.25%胰酶消化成骨誘導的MSCs，制成2×106/ml的細胞懸液， 吸取100 μl分別滴加到已置入24孔板的FBnHAC，nHAC材料表面，37℃，5%CO2，飽和濕度靜置2 h后，反轉材料，向每組材料另一面滴加100 μl細胞懸液， 37℃， 5%CO2，飽和濕度靜置培養2 h后，加上述成骨誘導培養液浸沒材料，置于孵箱中培養，在不同時相點（3，7，10，14 d)分別取材進行各項指標的觀測。

1.3 觀測指標

1.3.1 材料的細胞黏附率測定 接種后4 h分別取每組材料3個樣本， 0.25%胰蛋白酶消化， PBS洗滌3次，使黏附在材料上的細胞脫落， 細胞計數板進行計數，根據公式:細胞黏附率=(黏附細胞數/接種細胞數)×100%，計算細胞黏附率。

1.3.2 增殖細胞計數 細胞支架材料復合培養到第3，7，10，14天時，每組材料各取樣本3塊，PBS洗滌3遍，0.25%胰酶消化細胞，反復吹打支架后加入等量含10%FBS的培養基終止消化，取出支架，培養液離心，制懸，計數。

1.3.3 堿性磷酸酶表達量檢測 上述計數后的細胞懸液，在冰浴中用超聲細胞破碎機處理5次，6 s/次，共30 s。然后1 000 r/min離心5 min，取上清液按試劑盒介紹的方法算出堿性磷酸酶表達量。

1.3.4 掃描電鏡觀察 細胞與支架材料聯合培養7 d，每組分別取出1塊細胞支架復合物，10%的戊二醛固定，乙醇梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察細胞生長情況。

1.4 統計學分析 實驗數據以均數±標準差（±s）表示，采用SPSS11.5統計軟件中的兩獨立樣本間的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs的成骨誘導培養 MSCs 24 h后部分貼壁，貼壁細胞呈圓形或橢圓形，少部分細胞懸浮。5 d左右細胞鋪滿瓶底，多為梭形，形態比較一致，呈魚群樣排列（圖1）。10 d后細胞形態開始發生明顯變化， 部分細胞由長梭形轉變為立方形或多角形。

圖1 MSCs培養第5天形態(倒置顯微鏡×100)（略）

Fig 1 Morphologic characterization of MSCs for 5 d(inverted microscope×100)

2.2 I型膠原免疫熒光染色 大鼠MSCs經成骨誘導培養14 d后， I型膠原免疫熒光染色陽性，紅色熒光(Cy3)表示I型膠原在細胞內的分布，藍色熒光(hoechst33342)為細胞核(圖2)。 圖2 Ⅰ型膠原免疫熒光染色(熒光顯微鏡×400)（略）

Fig 2 Induced MSCs showing positive expression ofcollagen type I(fluorescent microscope×400)

2.3 材料的細胞黏附率測定 接種4 h后，纖維蛋白表面修飾后的支架材料細胞黏附率比非處理組明顯提高，分別為：實驗組(58.8±2.9)%，對照組(38.8±1.8)%。兩組之間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 增殖細胞計數 兩組材料中細胞隨培養時間延長逐漸增多，且相同時相點實驗組材料上的細胞數量均多于對照組，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。具體細胞數見表1。 表1 支架材料上細胞計數（略）

a：與對照組比較，P<0.05 2.5 堿性磷酸酶表達量檢測 如圖3所示，兩組堿性磷酸酶表達量第10天時到達最高峰，相同時相點實驗組堿性磷酸酶表達量高于對照組(P<0.05)。

Fig 3 Expression of ALP in two groups

2.6 掃描電鏡觀察支架材料及細胞支架復合物 nHAC(圖4a)和FBnHAC復合材料(圖4b)電鏡下顯示:FBnHAC的結構與nHAC基本一致，FBnHAC孔隙表面覆蓋了一層薄的網狀結構，但孔隙大小未受影響。7 d后電鏡下可見兩組材料上均有細胞生長，細胞在FBnHAC的表面和孔隙內生長良好，黏附的細胞數量較多，分泌的細胞外基質可見(圖4c)。nHAC表面黏附的細胞明顯減少，細胞之間少有突起連接(圖4d）。 (a) nHAC結構（×200)

(b) FBnHAC結構，孔隙內可見網狀結構（×200) (c) FBnHAC表面黏附的細胞較多，可見細胞外基質形成（×500) (d) nHAC表面黏附的細胞明顯減少（×500)

圖4 支架材料以及細胞支架聯合培養7 d 掃描電鏡觀察（略）

Fig 4 Scoffolds and MSCs cultured together withthe scoffolds for 7 days were observed byscanning electron microscope

3 討論 骨組織工程是指利用組織工程技術構建組織工程骨進行骨組織缺損的修復或重建。組織工程骨的構建可以分為3個主要步驟:種子細胞的增殖分化、支架材料的合成→種子細胞與支架材料復合→組織化人工骨植入體內，其中種子細胞和支架材料的選擇尤為重要。MSCs來源廣泛且在體外可大量擴增，在不同的誘導條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌肉細胞、神經細胞等多種細胞，目前已成為骨組織工程最重要的種子細胞［3］。成骨誘導培養后的大鼠MSCs為貼壁依賴型細胞， 與支架材料的生物相容性差異會影響細胞黏附、增殖、分化以及功能的表達。所以理想的支架材料必須具有良好的生物降解性和生物相容性、適宜的表面親水-疏水平衡、較強的細胞特異性識別能力以及一定的機械強度。目前， 清華大學廖素三等［4］研制的nHAC是基于仿生觀念骨替代材料，有良好的生物降解性和骨傳導性，晶體尺寸在納米量級， 且晶體和膠原分子的組裝結構與天然骨中礦物和膠原的組裝結構相同，具有與天然松質骨類似的三維孔洞網絡結構，孔隙大小約100 μm，有利于營養物質的運輸。孫偉等［5］應用nHAC材料和MSCs進行復合培養證實， nHAC可以作為支架材料應用于骨組織工程，且能與MSCs復合。 為了提高nHAC與細胞的生物相容性，對其進行一定的表面修飾是非常必要的。表面修飾旨在引入細胞與支架材料特異性相互作用位點，使細胞盡可能在類似體內細胞外基質環境中發揮其功能。本研究應用纖維蛋白表面修飾nHAC的方法簡單，可行性強，不但充分利用了所選用的細胞外基質蛋白的生物學特性， 而且保留了nHAC原有的基本結構。在修飾支架的過程中加入新鮮大鼠血漿，以提供活化的凝血酶及各種細胞因子，促使可溶的纖維蛋白原轉化為不溶的纖維蛋白，纖維蛋白可互相交織形成三維網狀結構覆蓋在nHAC孔隙表面，該網狀結構有良好的組織相容性，能較好地介導細胞信號傳導和細胞間相互作用，可釋放轉化生長因子和血小板衍生因子促進細胞黏附和增殖，并為細胞生長提供三維仿生空間。陳克明等［6］采用纖維蛋白作為載體材料復合MSCs，證實了纖維蛋白具有細胞可黏附性、合適的孔隙結構，是細胞培養的良好載體。 掃描電鏡觀察纖維蛋白修飾后的nHAC，我們發現在nHAC表面及孔隙內覆蓋一層薄的網狀樣結構，但孔隙大小未受影響，證實纖維蛋白成功修飾了nHAC。我們的研究表明，成骨誘導的MSCs復合纖維蛋白修飾的nHAC培養，材料表面及孔隙內黏附了大量的細胞，并可見細胞外基質的分泌；成骨誘導的MSCs復合單純的nHAC培養，材料表面及孔隙內分布少量細胞，細胞外基質少見，說明纖維蛋白修飾后的nHAC材料的細胞相容性明顯優于單純材料。隨著培養時間的延長，細胞增殖數量實驗組也均高于對照組，可能由于纖維蛋白還進一步改變了nHAC的親水性和帶電性，促進生長過程中的細胞匯合， 進而細胞通過旁分泌和自分泌作用進一步促進其自身的增殖生長。堿性磷酸酶表達量檢測結果顯示各時間點實驗組顯著高于對照組，說明成骨細胞在FBnHAC材料上的生長分化優于單純的nHAC材料，從另外一個方面也可說明新鮮大鼠血漿中的轉化生長因子、血小板衍生因子等可促進尚未分化的MSCs向成骨細胞分化，結果進一步提示纖維蛋白表面修飾對nHAC材料的細胞相容性有一定的優化作用。 總之，纖維蛋白修飾后的nHAC支架材料能促進成骨定向誘導的MSCs黏附、增殖及分化，一定程度上完善了nHAC材料的細胞相容性，為該支架材料進一步應用于骨組織工程奠定了基礎。