作者：史堅強 孫廣友，馬鵬， 徐成振錢棟徐曉峰

【摘要】 目的： 探討骨髓間充質(zhì)干細胞（marrow mesenchymal stem cells）復(fù)合音猬因子（sonic hedgehog，Shh）修飾的納米晶膠原基骨(nano Hydroxyapatite/collagen， nHAC)修復(fù)大鼠股骨缺損的效果。方法： SD大鼠 MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，種植于支架材料形成細胞支架復(fù)合物。SD大鼠30只制成股骨干5 mm節(jié)段性缺損，分為空白對照組：骨缺損處不植植入物，MSCs/nHAC組：植入MSCs/nHAC復(fù)合物，MSCs/ShhnHAC組：植入MSCs/ShhnHAC復(fù)合物。通過大體觀察、X線放射學(xué)、組織學(xué)對比各組骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果： SD大鼠MSCs在體外與nHAC，ShhnHAC復(fù)合培養(yǎng)第7天，電鏡掃描證實ShhnHAC更有利于MSCs黏附、增殖。術(shù)后第6、12周放射學(xué)檢查評價新骨生成各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后組織學(xué)檢查各組新骨生成速度、生成量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： MSCs/ShhnHAC復(fù)合物能夠修復(fù)SD大鼠股骨缺損， 修復(fù)效果明顯優(yōu)于MSCs/nHAC復(fù)合物。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細胞; 納米晶膠原基骨; 骨缺損; 音猬因子

［Abstract］ Objective: To explore the repair effect of the segmental bone defects in rats with nano Hydroxyapatite/collagen modified by bone marrow mesenchymal stem cells cocultured with sonic hedgehog(Shh）.Methods： MSCs obtained from SD rats bone marrow were induced and proliferated.After their osteoblastic phenotype had been demonstrated， MSCs were seeded onto the scaffolds.A bone defect(5 mm in length) was created in each rat and treated with three kinds of implantations.In blank control group， defect was filled with none; in MSCs/nHAC group with MSCs/nHAC compound; in MSCs/ShhnHAC group with MSCs/ShhnHAC compound.The repair effect of bone defect of every group was evaluated by general observation， radiographic examination and histologic analysis. Results： MSCs of SD rats were cocultured in vitro with nHAC， ShhnHAC separately for 7 days.The scanning through electron microscope confirmed that ShhnHAC was more conducive to adhesion and proliferation of MSCs.6 and 12 weeks after operation， radiology examination disclosed a significant difference of new bone formation between the groups(P<0.05); histological examination disclosed a significant difference of new bone formation in rate and quantity between the groups(P<0.05). Conclusion： The MSCs/ShhnHAC compound can repair the femoral bone defect of SD rats， and its effect of reparation surpassed the MSCs/nHAC compound obviously.

［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; nano Hydroxyapatite/ collagen; bone defects; sonic hedgehog嚴(yán)重創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、先天性畸形等導(dǎo)致的節(jié)段性骨缺損是骨科醫(yī)師面臨的臨床難題之一。利用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程骨治療骨缺損是具有臨床應(yīng)用價值的治療策略。骨髓間充質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是骨組織工程最重要的種子細胞，納米晶膠原基骨(nano Hydroxyapatite /collagen， nHAC)已經(jīng)作為人工合成生物支架材料替代骨缺損應(yīng)用于臨床［1］，研究表明其復(fù)合細胞后具有體內(nèi)成骨能力［2］。

音猬因子（sonic hedgehog，Shh）具有促進造血前體細胞增殖的作用［3］。在牙胚發(fā)育過程中，Shh 與BMP、FGF 和Wnt 協(xié)同作用，調(diào)控牙齒的發(fā)育和萌出［4］。本實驗以SD大鼠MSCs為種子細胞，以nHAC及ShhnHAC為支架材料體外共同培養(yǎng)，并采用構(gòu)建的組織工程骨對SD大鼠股骨缺損進行修復(fù)，采用大體觀察、X線、病理切片等指標(biāo)評價修復(fù)效果，為骨缺損治療中新型植入材料的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和試劑

健康雄性SD大鼠35只，由江蘇大學(xué)動物實驗中心提供；納米晶膠原基骨，由清華大學(xué)材料系提供；LDMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；地塞米松、維生素C、β甘油磷酸鈉、纖維蛋白原、Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，hoechst33342（Sigma公司）；小鼠抗大鼠I型膠原單克隆抗體(Santa Cruz公司)；Shh（PeproTech公司）。

1.2 方 法

1.2.1 SD大鼠MSCs的獲得、成骨誘導(dǎo)及傳代 頸椎脫臼處死SD大鼠，無菌條件下取其股骨、脛骨， 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的LDMEM 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔沖出骨髓，淋巴細胞分離液分離后，置入含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C， 10 mmol/L β甘油磷酸鈉的LDMEM培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)，3～4 d后首次半量換液，去除不貼壁細胞，以后每2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長分化情況。

待細胞融合成單層后（約長滿瓶底90%），進行消化傳代。用PBS液漂洗2次后，加入0.25%胰蛋白酶2 ml， 37 ℃靜置2～3 min，鏡下觀察到細胞收縮、間隙增大時，加入含10%胎牛血清的LDMEM 培養(yǎng)液中止消化，用吸管輕輕吹打細胞，直至貼壁細胞懸浮， 吸取細胞1 500 r/min離心5 min后，棄去上清液，加入成骨誘導(dǎo)劑吹打制成細胞懸液， 105/ml接種傳代。

1.2.2 ShhnHAC的制備 Shh溶于LDMEM中（20 ng/ml），nHAC切割成 6 mm×5 mm×5 mm大小，置于ShhDMEM中，負(fù)壓下真空抽吸，凍干24 h備用。

1.2.3 I型膠原免疫熒光染色 大鼠MSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，固定細胞，PBS洗滌，0.25% TrixonX100 37℃水浴1 h，3%牛血清白蛋白封閉，加小鼠抗大鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體（1∶100），37℃水浴4 h，PBS洗滌，滴加Cy3紅色熒光標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶300），37℃水浴1 h，PBS洗滌，加hoechst33342，室溫5 min，PBS洗滌，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 構(gòu)建組織工程骨 0.25%胰酶消化成骨誘導(dǎo)的MSCs，制成2×107/ml的細胞懸液，吸取100 μl分別滴加到已置入24孔板的ShhnHAC，nHAC材料表面，37℃， 5%CO2，飽和濕度靜置2 h后，反轉(zhuǎn)材料，向每組材料另一面滴加100 μl細胞懸液， 37℃， 5%CO2，飽和濕度靜置培養(yǎng)2 h后，加上述成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液浸沒材料，置于孵箱中培養(yǎng)。MSCs/nHAC，MSCs/ShhnHAC培養(yǎng)至第7天時，選取3個標(biāo)本，10%的戊二醛固定， 再經(jīng)1%四氧化鋨固定，乙醇逐級脫水（50%，70%，90%，95%，100% 各 5 min），CO2臨界點干燥或乙腈逐級處理。在真空干燥器內(nèi)用水泵減壓抽除乙腈溶劑，表面噴金后掃描電鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.5 骨缺損模型制備與修復(fù) 取SD大鼠30只， 1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，劑量為1 ml/kg。麻醉生效后，取俯臥位，術(shù)野處剪毛消毒， 取下肢后外側(cè)切口， 顯露股骨， 按照長骨缺損臨界值［5］用線鋸造成股骨中段5 mm(包括骨膜)的骨缺損模型。將30只大鼠分為3組（每組10只）：空白對照組（骨缺損處不植植入物），MSCs/nHAC組（植入MSCs/nHAC復(fù)合物），MSCs/ShhnHAC組（植入MSCs/ShhnHAC復(fù)合物）。術(shù)后每天觀察動物情況， 每天青霉素8萬單位腹腔注射， 連續(xù)3 d，不做內(nèi)外固定。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察 術(shù)后第6，12周腹腔麻醉下取各組5只SD大鼠行大體觀察。

1.3.2 X線檢查及放射學(xué)評分 術(shù)后第6，12周腹腔麻醉下行動物股骨正側(cè)位X線片檢查。X線片按LaneSandhu［6］評分標(biāo)準(zhǔn)評分。

1.3.3 組織學(xué)檢查 術(shù)后第6，12周各組取5個標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、HE染色、光鏡觀察骨缺損修復(fù)成骨情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，多組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)以±s來表示， P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下MSCs生長情況

MSCs 24 h后部分貼壁，貼壁細胞呈圓形或橢圓形，少部分細胞懸浮。5 d左右細胞鋪滿瓶底，多為梭形，形態(tài)比較一致，呈魚群樣排列。10 d后細胞形態(tài)開始發(fā)生明顯變化， 部分細胞由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎叫位蚨嘟切巍?/p>

2.2 I型膠原免疫熒光染色結(jié)果

大鼠MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后， I型膠原免疫熒光染色陽性，紅色熒光(Cy3)表示I型膠原在細胞內(nèi)的分布，藍色熒光(hoechst33342)為細胞核(圖1)。

2.3 MSCs與nHAC，ShhnHAC復(fù)合培養(yǎng)情況

掃描電鏡觀察， MSCs復(fù)合到ShhnHAC支架后第7天，材料表面及孔隙內(nèi)見大量細胞黏附增殖，胞質(zhì)間相互融合，并有大量的細胞外基質(zhì)分泌(圖2a)。MSCs/nHAC培養(yǎng)至第7天，材料表面黏附的細胞較少，分泌的細胞外基質(zhì)少見(圖2b)。

2.4 實驗動物一般情況及標(biāo)本大體觀察結(jié)果

各組大鼠術(shù)后約3 h清醒，術(shù)側(cè)肢體活動欠佳。所有動物約7 d切口一期愈合， 無炎癥及內(nèi)植物排出。空白對照組始終不能自身修復(fù)，被脂肪、纖維組織填充。MSCs/nHAC組術(shù)后第6周時部分骨痂形成，缺損仍較明顯；術(shù)后第12周時MSCs/nHAC大部分降解， 缺損較術(shù)前有所減小，但界線仍可辨認(rèn)，骨折未完全愈合。MSCs/ShhnHAC組術(shù)后第6周時標(biāo)本清晰可見， 材料與骨缺損的界面模糊，部分降解呈顆粒狀；術(shù)后12周時材料與骨缺損的界面基本消失，骨缺損表面平滑、質(zhì)地硬，表面有骨膜覆蓋。

2.5 X線檢查結(jié)果

空白對照組術(shù)后第6，12周時骨缺損均較明顯。MSCs/nHAC組術(shù)后第6周時X線可見云霧狀的新生骨痂，12周時缺損區(qū)可見大量骨痂，未見塑形。MSCs/ShhnHAC組術(shù)后第6周時X線見MSCs/ShhnHAC支架降解及少量骨組織形成，骨缺損處間隙模糊；12周時X線可見骨痂連續(xù)，骨髓腔通暢且新形成骨組織與已降解MSCs/ShhnHAC支架外形大體相似。骨缺損放射學(xué)評分結(jié)果見表1。表1 3組術(shù)后第6，12周骨缺損區(qū)放射學(xué)評分比較

2.6 組織學(xué)觀察結(jié)果

空白對照組術(shù)后至第12周未見骨缺損獲得骨性修復(fù)， 骨缺損處由纖維結(jié)締組織填充。

MSCs/nHAC組術(shù)后第6周缺損區(qū)域周圍有結(jié)締組織長入， 兩骨斷端缺損區(qū)域有少量成骨細胞生長（圖3a）。術(shù)后12周: 大多標(biāo)本的材料未完全降解，與周圍組織界線可辨認(rèn)，植入?yún)^(qū)域有少量骨組織形成， 雖有血管長入， 但骨陷窩數(shù)目較少（圖3b）。

MSCs/ShhnHAC組術(shù)后第6周移植物組織內(nèi)微小血管增多， 內(nèi)部孔隙可見類基質(zhì)沉積， 含胞質(zhì)豐富的成骨細胞，骨缺損部分區(qū)域出現(xiàn)比較成熟的骨組織結(jié)構(gòu)，但支架材料與周圍的骨組織界線清楚（圖3c）。術(shù)后12周: 移植區(qū)域出現(xiàn)大量成熟骨結(jié)構(gòu)， 骨皮質(zhì)連續(xù)， 骨組織與周圍組織分界不清， 缺損區(qū)域骨結(jié)構(gòu)與正常骨結(jié)構(gòu)大致相同， 骨皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)連續(xù)， 髓腔通暢（圖3d）。

3 討 論

創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因造成的骨缺損、骨不愈合一直是骨科治療的難題之一，目前常用的治療方式主要有自體骨移植、異體骨移植和人工骨移植。自體骨移植修復(fù)骨缺損效果最好，缺點是骨源有限、取材不便，患者取骨處受到削弱，增加患者痛苦；異體骨存在排斥、吸收、不愈合可能等缺點；人工骨缺乏骨誘導(dǎo)成分，成骨能力較弱。骨組織工程學(xué)的興起，為解決此類難題提供了可能性。目前對骨組織工程的研究主要集中在種子細胞、支架材料和骨組織構(gòu)建等3個方面。

MSCs是目前是公認(rèn)的骨組織工程理想的種子細胞，具有取材方便，增殖能力、成骨能力強，免疫原性弱等特點［7］，在目前骨組織工程中應(yīng)用非常普遍。nHAC是基于仿生觀念骨替代材料，有良好的生物降解性和骨傳導(dǎo)性，具有與天然松質(zhì)骨類似的三維結(jié)構(gòu)。研究證實［8］，nHAC可作為骨缺損替代物和支架材料。黃永輝等［1］將nHAC應(yīng)用于臨床，證實其效果接近自體骨移植，達到自體骨移植的金標(biāo)準(zhǔn)，是一種理想的骨修復(fù)材料。馬鵬等［9］用纖維蛋白修飾nHAC支架材料，發(fā)現(xiàn)纖維蛋白修飾后的nHAC支架材料能促進成骨定向誘導(dǎo)的MSCs黏附、增殖及分化。

Shh最初是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的重要發(fā)育調(diào)控因子，特別對哺乳動物骨骼發(fā)育和重建調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用，其信號的靶基因可能包括Ptc，wnt，Bmp，Msx等［4］。Warzecha等［10］用Shh誘導(dǎo)MSCs向軟骨細胞分化中發(fā)現(xiàn)：Ⅱ，Ⅹ軟骨膠原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）增加。Foppiano等［11］用Shh誘導(dǎo)MSCs向成牙細胞轉(zhuǎn)化過程中發(fā)現(xiàn)：堿性磷酸酶(ALP)活性表達增加，成骨細胞表型陽性。Kinto等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Shh可誘導(dǎo)成骨細胞分化和異位骨形成。上述研究表明Shh復(fù)合MSCs支架修復(fù)骨缺損是可行的。

本實驗將SD大鼠MSCs分別與nHAC，ShhnHAC復(fù)合來構(gòu)建組織工程骨，用于修復(fù)同種異體SD大鼠股骨缺損。結(jié)果顯示： MSCsnHAC有一定骨修復(fù)能力，ShhnHAC支架材料較單純的nHAC更有利于MSCs的黏附、增殖。植入的nHAC支架可逐步降解，未出現(xiàn)排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，是較理想的支架材料；MSCs/ShhnHAC較MSCs/nHAC成骨較早且骨痂生成較多，能更快更有效地促進骨缺損的愈合，其成骨方式主要為軟骨內(nèi)成骨。這說明Shh可以促進成骨細胞的分化、增殖和骨骼的成形，MSCs/ShhnHAC復(fù)合物較MSCs/nHAC及nHAC有更好的促進修復(fù)作用，為研發(fā)新的高活性的骨科植入替代物提供了新的思路和方法。