作者：居會祥， 戴真煜， 孫明忠， 呂晶晶

【摘要】 目的： 研究不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。方法： 采用共沉淀法制備得到不同粒徑FeOx，將不同粒徑FeOx吸附于細胞表面，并加載靜磁場(SMF)及100 Hz交變磁場(EMF)照射。運用CCK8檢測納米粒子吸附后在外加磁場作用下Bel7402細胞增殖情況，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡、死亡率及細胞周期變化。結果： 不同粒徑磁性納米FeOx在SMF照射時間低于72 h時能使Bel7402細胞增殖速度增快，當照射時間大于72 h時，細胞增殖速度未發生明顯變化但部分細胞發生凋亡，凋亡率為(3.1±0.78)％。而經EMF照射后37 nm FeOx吸附細胞增殖被抑制，細胞周期實驗結果表明大部分細胞被阻滯在G0/G1期，細胞出現大量死亡與凋亡，凋亡率達到(23.34±3.6)％、死亡率達到(57.24±2.7)％。結論： 納米粒子未有外加磁場照射時不能對細胞產生明顯的影響，外加SMF照射時，細胞的增殖及DNA代謝未發生明顯的變化，但細胞發生凋亡；外加EMF照射時，細胞增殖被抑制并發生明顯的凋亡及死亡，細胞DNA代謝明顯紊亂，且具有較小粒徑的磁性納米FeOx在EMF作用下對肝癌細胞影響最為顯著。

【關鍵詞】 磁性納米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期 ［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.

［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle

磁性納米材料具有良好的磁導向性、較好的生物相容性、生物降解性和活性能基團等特點［1-3］，它可結合各種功能分子，如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、控制釋放、酶的固定化、免疫測定、DNA和細胞的分離與分類等領域可望有廣泛的應用。磁性納米材料特別是Fe屬納米顆粒已經被廣泛應用于藥物靶向治療及干細胞定向移植治療中［4］。當粒徑在30～200 nm之間時，矯頑力和飽和磁化強度均達到最大值，且具有單疇特性。目前已有納米磁性氧化鐵等顆粒作為藥物或干細胞載體用于肝癌動物實驗的研究，但對磁性納米氧化鐵粒子本體對人體研究相對較少［5］。本研究以肝癌細胞Bel7402為對象，觀察不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對其生物學特性的影響，旨在為FeOx用于治療肝癌提供實驗依據。 1 材料和方法 1.1 試劑及儀器 肝癌細胞株Bel7402購自中國科學院上海細胞庫。靜磁場發生儀為兩塊強磁場稀有金屬鎳/鐵永磁體，當兩塊磁體間距為2.5 cm時其場強為0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉計/高斯計為上海亨通磁電科技有限公司產品。變頻儀(FT1000型)為南京萬臣電子有限公司產品，變壓器(PT800型)為上海富濟電子公司產品。胰蛋白酶、Primilar1640培養基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，維生素C、青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產品。CCK8試劑盒為美國ADL公司產品，細胞凋亡及周期試劑盒均購自美國BD公司。FeSO4、醋酸鋅均為分析純，購自南京化學試劑有限公司。掃描電鏡(SEM)型號為HITACHIX650，X射線衍射儀(XRD)型號為Philips X′pert XRD system型。 1.2 方法

1.2.1 磁性納米FeOx的制備

運用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸鋅為反應物，反應在乙醇、水（1∶3）混合溶劑中進行并加入質量百分比為2％的甘油，制備得到醋酸亞鐵前驅體，前驅體粉末灼燒溫度為400℃，灼燒4 h后得到FeOx粉體，10 000 r/min離心30 min，得到上下兩層不同粒徑粉末，經SEM及XRD實驗確定其粒徑及成分組成。SEM實驗前樣品用超聲清洗儀超聲分散10 min。XRD實驗條件為：掃描速率為2θ/min，測定納米粉體XRD譜。

1.2.2 磁性納米FeOx吸附細胞實驗

將不同粒徑納米FeOx加入到細胞培養瓶中與細胞共同培養。納米粒子吸附細胞方法為：將細胞消化成細胞懸液并調整細胞濃度大于105個/ml，再將不同粒徑納米粒子加入到細胞懸液中并在恒溫搖床中勻速振蕩30 min，搖床搖速為200 r/min。振蕩完成后將細胞置于細胞培養箱中培養。細胞培養2 d后經SEM實驗確定磁性納米FeOx結合效率。

1.2.3 細胞培養

細胞種植到含10％FBS PIMIRIER 1640培養基的培養瓶，放置在37℃，5％CO2培養箱持續培養。細胞傳代時用胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）1 500 r/min 15 min離心洗滌2次，用含10％FBS 1640培養基重懸細胞后種植細胞，每次細胞種植濃度應大于105個/ml。細胞臨時保存在-70℃超低溫冰箱，永久保存在液氮罐中，細胞凍存液配比為DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(體積比)，細胞凍存濃度應高于106個/ml。

1.2.4 磁場照射細胞方法

靜磁場(SMF)照射細胞方法為：將細胞培養瓶置于兩塊永磁體之中，同時置于細胞培養箱中培養，每間隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交變磁場(EMF)照射細胞方法為：將細胞培養瓶置于離工作線圈頂端2 cm，經特斯拉計測量磁感應強度為0.67 mT，每間隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液進行各種檢測。

1.2.5 CCK8細胞增殖實驗

按試劑盒提供實驗方法進行。首先取出96孔酶標板，依照次序對應分別加入50 μl的標準品于酶標板微孔中，分別標記樣品編號，將50 μl細胞培養懸液（2.5×104個/ml）加入到酶標板中；在標準孔和樣品孔中加入100 μl的酶標記液，36℃孵育1 h，將溶液傾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反應15 min后加入終止液50 μl，終止反應。測定450 nm的光密度值。每隔12 h重復進行以上步驟，72 h得到細胞增殖數據繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 細胞凋亡、死亡及周期實驗

細胞凋亡及周期實驗均在流式細胞儀上完成，均按試劑盒提供實驗方法進行。凋亡實驗方法為：將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液，并用PBS洗滌2次并將細胞濃度重懸調整為106個/ml。染色過程為首先用微量移液槍移取20 μl細胞懸液，然后用AnnexinV加入到細胞懸液中并避光靜置15 min后將PI染料加入并靜置30 min，染色完成后上機實驗。細胞周期實驗方法為：首先按凋亡實驗相同方法處理細胞以待上機檢測，染色方法為將試劑盒內A，B，C，D 4種試劑按順序分別加入到細胞懸液中，避光靜置時間均為15 min。染色完成后上機實驗。流式細胞儀實驗條件為：細胞進樣流速中速，前向角補償電勢為56 V。

1.2.7 統計分析

實驗結果用±s表示，使用SPSS13.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果 2.1 納米FeOx表征實驗結果 SEM及XRD實驗結果表明兩種粒子的平均粒徑分別為37，70 nm左右，粒子形狀為不規則球形（圖1，2）。根據Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D為粒子粒徑，K為形狀因子，λ為X 衍射的波長，β為衍射峰的半峰寬，θ為衍射角。經XRD實驗結果證明粒子中Fe，O兩種元素的比例為1∶1.12。圖3為2種FeOx與Bel7402細胞吸附情況，圖中FeOx為黑色顆粒，FeOx與Bel7402細胞發生了較為明顯的吸附，37 nm粒子更易于在細胞表面吸附，表現為每個細胞表面吸附粒子數量明顯增加。 (a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)

2.2 細胞增殖實驗結果 不同粒徑納米FeOx在未經磁場照射時并未對細胞增殖產生明顯的影響，細胞經SMF照射其增殖在磁場照射初期速度變快，當照射時間超過72 h后增殖未發生明顯改變(相對對照組)。 經EMF照射后兩種粒子吸附細胞的增殖均被抑制，當EMF照射時間為5 h時細胞增殖抑制率達到最大，37nm FeOx抑制率達到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率為（53.56±5.2）％。

2.3 細胞凋亡及死亡實驗結果 從表1可見，凋亡率、死亡率3組間比較差異無統計學意義，說明未經磁場照射的納米粒子不能導致細胞死亡及凋亡。表2可見37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經SMF照射達到60 h后，細胞發生凋亡，當照射時間為72 h時37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率僅為（1.25±0.23）％。而未經磁場照射37nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.02±0.04）％，未經FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經SMF照射細胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。 表3表明隨著EMF照射時間的延長，細胞凋亡率隨之增加，當照射時間達到5 h時其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（12.54±6.7）％，死亡率為（37.28±4.2）％。當照射時間超過5 h后，細胞凋亡率增速變慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）

2.4 細胞周期實驗結果 從表4可見，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長細胞周期，與未經處理Bel7402細胞作比較，無統計學意義，與凋亡實驗結果相符，表明FeOx吸附細胞并不能影響細胞周期代謝。表5表明當細胞被納米粒子吸附并在外加SMF照射下細胞DNA代謝未發生紊亂，在SMF照射初期細胞處于S，G1期細胞比例增加，細胞增殖變快，與細胞增殖實驗結果吻合，當照射時間超過72 h后細胞處于G0期含量增加，細胞進入增殖靜止期。凋亡實驗結果表明此時細胞發生明顯的凋亡，表明細胞凋亡通路被激活，細胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然增殖細胞周期實驗結果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經SMF照射細胞周期實驗結果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。 表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞在外加EMF作用下，細胞DNA代謝均發生明顯變化，細胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h時37 nm粒子吸附細胞值為（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附細胞值為（63.5±2.4）％，細胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經EMF照射細胞周期實驗結果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。 3 討論 磁性納米材料已經被用作藥物或干細胞的載體用于各種疾病的靶向治療［6］，但現有研究多集中于納米粒子與藥物或干細胞的吸附研究，對磁性納米粒子本體在外加磁場作用下對細胞或生物體影響的研究較少，本研究即以磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞Bel7402的影響為研究對象。 我們采用共沉淀法制備得到的納米FeOx粒子的平均粒徑分別為37 nm及70 nm且粒徑分布均勻。粒子形狀為不規則球形，XRD實驗結果表明粒子的表面有較多的空間位隙，導致粒子中兩種元素的化學計量比不規則，其Fe與O計量比為1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的納米粒子更容易吸附小分子物質或更容易吸附在其他物質表面［7］，本文合成得到的納米粒子具有較多的晶格缺陷，實驗用納米FeOx較易在細胞表面發生吸附。 細胞增殖實驗表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在細胞表面后在SMF照射條件下，細胞增殖速度在照射初始階段增加，當照射時間超過72 h后細胞發生凋亡，但增殖速度未發現明顯變化，可能由于FeOx吸附細胞后在SMF照射條件下更易沉降到細胞培養瓶底部。納米FeOx并不能影響細胞的正常分裂與增殖，同時SMF照射細胞也不能引起細胞發生改變，與文獻報道結果類似［8］。EMF照射細胞能抑制細胞增殖，細胞增殖時間明顯延長，當EMF照射時間達到5 h后，EMF照射FeOx吸附細胞抑制達到最大。比較兩種FeOx吸附細胞在EMF照射條件下細胞增殖結果可以得出，37 nm FeOx粒子對細胞的增殖抑制更為顯著，表明納米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌細胞的增殖。 EMF照射細胞本身能影響細胞的增殖，導致細胞早期凋亡以及細胞DNA代謝發生紊亂和DNA雙鏈斷裂［9］。本研究表明，納米粒子吸附到細胞表面后在外加EMF作用條件下這種影響更為明顯，具有更小粒徑的FeOx在EMF作用下對細胞凋亡的影響更為顯著。同時，隨著EMF照射時間增加，FeOx吸附的細胞DNA代謝發生紊亂，大部分細胞被阻滯在G0/G1期，同時處于S期的細胞含量減少，表現為明顯的S期和G2 期阻滯。 納米粒子在吸附到細胞表面后可一定限度地改變細胞表面電勢，EMF同樣能改變細胞表面的電勢而導致細胞發生凋亡等生理現象［9，10］。兩種外加因素對細胞的影響有明顯的疊加效果，納米FeOx在外加EMF作用下發生明顯的振蕩現象能較大程度改變細胞膜表面的電勢分布，從而改變Na+，K+，Ca2+等離子通過細胞膜表面的速度和方向，Ca2+代謝與細胞的凋亡相關，Na+，K+與細胞死亡和DNA代謝相關［10］。同時，納米FeOx在磁場作用下發生振蕩能導致明顯的熱效應［11］，導致細胞發生凋亡或死亡以及導致細胞DNA發生明顯的代謝紊亂。37 nm FeOx在外加EMF作用下對Bel7402的影響更為明顯，在EMF作用下振蕩更為劇烈［12］。 綜上所述，不同粒徑磁性納米FeOx吸附在細胞表面并不能影響細胞的增殖，也不能導致細胞發生凋亡或DNA代謝紊亂；在SMF照射時，在磁場照射初期能提高吸附有納米粒子的細胞增殖速率，當照射時間達到72 h時能導致細胞發生凋亡；在EMF照射時，吸附有納米FeOx細胞的凋亡及死亡率急劇變大，表明磁性納米粒子與EMF對細胞的作用有疊加效果，具有較小粒徑的納米FeOx在EMF作用下對細胞的影響更為劇烈。磁性納米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制細胞的增殖。對納米粒子在細胞表面的吸附率、與細胞的融合以及對細胞膜表面電勢的影響及熱效應還需進行更為深入的研究。