作者：莫志宏 楊琳玲 楊小超 陳自鋒

【摘要】 利用Hg2+與DNA中胸腺嘧啶(T)結合的高度特異性和納米金在石英晶體微天平(QCM)上的信號放大作用，設計了一種簡便靈敏的Hg2+檢測方法。納米金采用檸檬酸鈉還原法制備，其表面用末端帶巰基的寡核苷酸探針進行自組裝修飾，并用6巰基己1醇(MCH)部分取代表面探針，以減少雜交空間位阻。結果表明，寡核苷酸鏈長為9bp、T個數為7的序列具有較高靈敏度；線性范圍為5.0～100 nmol/L；檢出限為2.0 nmol/L；Ca2+、Mg2+等其它金屬離子無明顯干擾。用于環境水樣中Hg2+的測定， RSD<2.9%；加標回收率為97.3%～101.2%。

【關鍵詞】 汞離子，寡核苷酸，納米金，石英晶體微天平

Abstract A simple and sensitive method was developed for the detection of mercury ions with quartz crystal microbalance(QCM)， based on the specific thymine(T)Hg2+T structure and gold nanoparticles. The gold nanoparticles were prepared by the citrate reduction method. In a selfassembled way， the particle surface was modified with the probe oligonucleotides which were partially replaced by 6Mercaptohexan1ol to reduce the steric hindrance of hybridization. The sensitivity was optimized by the oligonucleotide with a strand length of 9bp and a T number of 7. The linear range was 5.0－100 nmol/L with a detection limit of 2.0 nmol/L. And Ca2+， Mg2+ and other metal ions had no significant interferences. This method was successfully applied for the detection of Hg2+in environmental water samples， with RSD less than 2.9% and recoveries of 97.3%－101.2%.

Keywords Mercury ion， oligonucleotide， gold nanoparticle， quartz crystal microbalance

1 引 言

汞對人體健康危害嚴重[1，2]，是水環境監測的重要指標。環境水樣中Hg2+的測定主要采用等離子體原子發射光譜法和質譜法[2，3]、熒光法[4，5]和電化學法[6，7]等。目前，這些方法或需要昂貴的儀器，不適合現場分析；或靈敏度和選擇性不能滿足環境監測要求，需要進行分離富集，操作繁瑣費時。研究發現，Hg2+能介導胸腺嘧啶(T)配對，形成穩定的THg2+T特異性結構[8]；并由此研究了具有良好選擇性的Hg2+檢測方法，包括熒光猝滅[9]、納米金凝聚比色[10～13]等。但上述方法的靈敏度還有待進一步提高。石英晶體微天平（QCM）是一種基于壓電效應的高靈敏質量傳感器（靈敏度可達ng級），裝置簡單，使用方便，已廣泛應用于生物化學傳感檢測[14]。文獻報道采用聚噻吩[15]和黑色素[16]修飾QCM金電極來實現對Hg2+的檢測，靈敏度高，但特異性較差。本研究利用Hg2+與T結合的高度特異性和納米金在QCM上的信號放大作用，如圖1所示，設計出富含T的寡核苷酸序列A與B，分別修飾在QCM金電極和納米金表面；只有當溶液中存在Hg2+時，A與B才能通過Hg2+的介導配對雜交；此時QCM電極表面質量發生明顯變化，從而建立了靈敏、特異的檢測Hg2+的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV2450型紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；TECRAI20型透射式電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；PSC2UD01壓電芯片與EXCE100壓電傳感實時分析儀(重慶大學微系統研究中心)；AA2610 型原子吸收分光光度計(北京華洋光學儀器開發公司) ;汞空心陰極燈(北京真空儀表廠) 。

1.00 mmol/L Hg(NO3)2標準溶液；緩沖液為10 mmol/L NaH2PO4Na2HPO4+0.10 mol/L NaNO3（pH 7.4，記為PBN）；Piranha溶液：V（70% H2SO4）∶V（30% H2O2）=3∶1；設計DNA序列（如圖3a所示，上海生物工程有限公司）；氯金酸和檸檬酸鈉（Amresco公司）；所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 納米金的制備

用檸檬酸鈉還原法[1７]制備納米金（NG），將9.72×10－4 mol/L氯金酸水溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸鈉，使其在反應體系中的濃度為4.36×10－3 mol/L，恒溫加熱攪拌10 min，停止加熱繼續攪拌至室溫。用紫外可見分光光度計掃描所制備納米金的吸收光譜，最大吸收峰為517.5 nm；用掃描電鏡觀測納米金粒徑約為（10±1.8）nm，納米金粒子濃度為32 nmol/L。

2.3 QCM金電極表面的寡核苷酸修飾

鍍金石英晶片在使用前用Piranha溶液清洗5 min，用N2吹干，加入1 μmol/L巰基修飾的寡核苷酸A溶液在室溫下自組裝12 h，然后用PBN緩沖液清洗。為避免DNA在金電極上自組裝時出現相互纏繞或DNA磷酸骨架與金電極的非特異性吸附，采用寡核苷酸A與6巰基己1醇(MCH)摩爾比為1∶10的混合液在QCM金電極表面自組裝。

2.4 納米金表面的寡核苷酸修飾

取10 nm的納米金溶液（濃度為32 nmol/L）100 μL，加入與納米金摩爾比為200:1的巰基修飾的寡核苷酸B溶液，室溫反應24 h后，在PBN中室溫靜置老化48 h，以16000 r/min離心30 min，除去上清液清洗兩次后，分散到PBN中；再加入20 μL 0.10 mmol/LMCH溶液，混勻，放置30 min后加入等體積的乙酸乙酯[1８]，使反應終止，離心方法同上，最后分散到100 μL PBN中，納米金濃度保持在32 nmol/L。MCH起到封閉納米金表面上的非特異性結合位點和部分取代表面寡核苷酸的作用，以降低納米金表面寡核苷酸密度、減少空間位阻、提高雜交效率。

2.5 Hg2+的檢測

在QCM檢測池中加入380 μL PBN，啟動QCM檢測平臺，開始記錄頻率，頻率（f0）穩定后，分別加入10 μL寡核苷酸修飾納米金(BNG)和待測Hg2+溶液，觀測QCM頻率變化（Δf=f－f0），頻率穩定后，加入與Hg2+形成更穩定螯合物的半胱氨酸溶液(1 mmol/L)[1９]，進行傳感器的再生。Δf與電極表面質量變化成正比，而質量變化取決于QCM電極表面結合的納米金；據此，Δf與溶液中Hg2+濃度成正比，用于Hg2+的定量檢測。檢測在室溫下進行。

３ 結果與討論

3.1 Hg2+介導TT配對的QCM頻率響應特性

加入Hg2+溶液，QCM頻率變化時間關系如圖2曲線a所示。曲線b為不含任何金屬離子的空白實驗。由圖2可見，加入BNG后頻率幾乎沒有變化，說明不存在Hg2+時，B沒有與A雜交形成雙鏈，并且還沒有吸附；加入Hg2+之后，頻率下降并最終達到平衡，說明通過堿基T和Hg2+的配位作用，在金電極表面形成了納米復合物，導致頻率大幅下降。頻率穩定后，加入半胱氨酸溶液，頻率迅速回升，并最終與未加Hg2+時的頻率基本重合。這是由于半胱氨酸能與Hg2+形成更穩定的螯合物，從而奪取THg2+T結構中的Hg2+[19]，使納米復合物分解，將BNG從金電極表面上釋放出來，實現了傳感器再生。

3.2 寡核苷酸鏈長度與T個數的影響

寡核苷酸的鏈長和T個數對Hg2+檢測靈敏度有較大影響。實驗設計了5組寡核苷酸序列（見圖3a），以考察鏈長和T個數對Hg2+檢測的影響，結果如圖3b所示。由圖3b可見，對應QCM頻率下降程度從大到小的序列依次為2＞3＞4＞1＞5。其原因可能是當DNA鏈中不含堿基T或所含堿基T過少時（序列1和5），納米復合物難以形成或不穩定；而含堿基T過多時（序列3）與含堿基T少時（序列2）相比，每個寡核苷酸可結合更多的Hg2+，使靈敏度降低；而全部為堿基T時（序列4），除了納米金與QCM金電極表面的寡核苷酸配對外，不同納米金表面的寡核苷酸之間也可能配對，只有部分Hg2+在電極表面形成納米復合結構，導致靈敏度降低。本實驗選擇鏈長為9 bp、含7個T的序列2用于Hg2+檢測。

對5.0×10－3～2.0 μmol/L濃度范圍內的Hg2+溶液進行了測定，結果見圖4。隨著Hg2+濃度增加，頻率下降程度明顯增大；但當Hg2+濃度 > 1.0 μmol/L時，濃度對頻率影響不大，說明QCM電極表面納米復合物基本達到飽和。在5～100 nmol/L范圍內，頻率變化與濃度呈線性關系，相關系數為0.97，靈敏度為2.8 Hz·L/nmol。以6次空白測量值標準偏差的3倍除以斜率計算得檢出限為2.0 nmol/L。

3.4 其它離子的干擾和樣品分析

為考察本方法的選擇性，配制了濃度均為0.50 μmol/L的Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Co2+、Pb2+、Cd2+、Zn2+、Fe3+和Hg2+單一組分的標準溶液，實驗條件同上，觀察QCM頻率的變化，結果如表1所示。除了對Pb2+有微弱的響應之外，其它離子均無響應。表明該方法對Hg2+具有良好的選擇性。表1 不同金屬離子對應的QCM頻率響應（略）

取某染織廠附近河水，靜置過濾除去懸浮顆粒，按實驗方法進行測定，并同時測定樣品中標準加入回收率，所得結果（見表2）滿意。本方法靈敏度高，操作簡便， 適用于環境水樣中Hg2+的測定。3.5 結論 將納米金和DNA相結合，設計了一種基于納米金放大的QCM檢測方法，實現了對水中Hg2+離子的檢測。本方法與熒光法、比色法等相比，靈敏度高，背景干擾小，無需復雜的熒光檢測設備?？梢酝ㄟ^人工合成能特異結合其它金屬離子的堿基，并檢測這些金屬離子[20]。