作者：張富軍，任娟，王飛苗，呂社民，李冬民

【摘要】 目的 探討不同抗原修復(fù)法對(duì)DA.1U大鼠肝組織內(nèi)核受體檢測(cè)結(jié)果的影響。方法 應(yīng)用微波修復(fù)法、高壓修復(fù)法、酶修復(fù)法和高壓加酶修復(fù)法對(duì)DA.1U大鼠肝組織切片進(jìn)行修復(fù)，然后進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果 DA.1U大鼠肝組織內(nèi)核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR經(jīng)高壓抗原修復(fù)后，染色陽(yáng)性強(qiáng)度較其他修復(fù)方法明顯增強(qiáng)，而且定位較佳。結(jié)論 在核受體免疫組化染色中高壓抗原修復(fù)法染色效果優(yōu)于其他抗原修復(fù)法。

【關(guān)鍵詞】 核受體；免疫組織化學(xué)；抗原修復(fù) ABSTRACT: Objective To explore the effects of different methods of antigen retrieval on the results of immunohistochemical staining of nuclear receptors. Methods Antigens were retrieved by using microwave oven， autoclave， enzyme and autoclave plus enzyme， respectively， in liver sections from DA.1U rats， followed by immunohistochemical staining. Results After antigen retrieval with autoclave， the positive staining intensity of nuclear receptors LXRα， LXRβ， PPARγ and FXR in the liver sections from DA.1U rats was enhanced obviously， and the location of nuclear receptors was better by using this method than the others. Conclusion In the immunohistochemical staining of nuclear receptors， using autoclave to retrieve antigens is the best method.

KEY WORDS: nuclear receptor; immunohistochemical staining; antigen retrieval

核受體在生物體內(nèi)廣泛分布，與配體結(jié)合后活化，調(diào)控基因的表達(dá)，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR在糖、脂代謝調(diào)控中起重要的作用，參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

免疫組織化學(xué)染色是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，用標(biāo)記的特異抗體對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量研究。甲醛溶液固定導(dǎo)致許多抗原決定簇被掩蓋，不能與抗體很好結(jié)合。核受體位于核內(nèi)，鏡下觀察染色結(jié)果時(shí)，若隱若現(xiàn)，抗原表達(dá)不均勻。為了解決該問(wèn)題，使抗原決定簇能很好的暴露出來(lái)，我們采取了微波修復(fù)法、高壓熱修復(fù)法和酶修復(fù)法等。抗原修復(fù)方法對(duì)DA.1U大鼠肝組織切片進(jìn)行修復(fù)；比較分析不同抗原修復(fù)法對(duì)DA.1U大鼠肝組織內(nèi)核受體免疫組化染色結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Olympus DP71圖像分析儀。LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR抗體購(gòu)自Abcam公司；免疫組化(SP法)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 組織材料 病理切片來(lái)自DA.1U大鼠糖尿病模型肝組織，經(jīng)40g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，5μm厚，每個(gè)蠟塊各切5片。

1.3 抗原修復(fù)

組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.02mol/L PBS沖洗后抗原修復(fù)。

1.3.1 微波修復(fù)法

將切片插入塑料切片架，放置于盛有150mL 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的容器中，置微波爐內(nèi)加熱1min 40s，使緩沖液溫度保持于82℃以上。取出切片架，室溫放置3min，然后將切片架置于涼水中冷卻15min。

1.3.2 高壓修復(fù)法

將切片插入金屬架，放置于盛有400mL 0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的燒杯中，將燒杯放入高壓鍋內(nèi)，蓋鍋、壓閥。待煮沸噴氣后，計(jì)時(shí)2～3min，然后將壓力鍋端離電爐，自然冷卻20min后取出切片。

1.3.3 酶修復(fù)法

將復(fù)合消化液滴加于切片組織上并完全覆蓋，將切片放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中消化10min。

1.3.4 高壓加酶修復(fù)法

按上述方法高壓修復(fù)后取出切片，蒸餾水沖洗，PBS洗2min×3次后，將復(fù)合消化酶滴加于切片組織上并完全覆蓋，將切片放入濕盒內(nèi)，37℃溫箱中消化3min。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

經(jīng)上述步驟處理后的切片均用PBS沖洗3次，各5min；滴加正常動(dòng)物血清封閉液，室溫放置20min，甩去多余液體；每張切片滴加Ⅰ抗30μL，4℃過(guò)夜，次日37℃復(fù)溫45min，PBS沖洗2min×3次；每張切片滴加生物素標(biāo)記Ⅱ抗30μL，37℃ 20min，PBS沖洗5min×3次；滴加鏈酶親和素過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37℃ 20min，PBS沖洗5min×3次；DABH2O2顯色，在顯微鏡下控制染色程度，自來(lái)水沖洗10min；蘇木素復(fù)染。以PBS替代Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

核受體LXRα、LXRβ、PPARγ和FXR均表達(dá)于核內(nèi)，以核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性。對(duì)4種核受體抗原采用4種抗原修復(fù)方法，以PPARγ為例說(shuō)明(圖1)：①陰性對(duì)照，未見特異性免疫染色，肝細(xì)胞核均被蘇木素染為藍(lán)色；②不修復(fù)，可見肝細(xì)胞核均為藍(lán)色，未見棕色顆粒；③微波修復(fù)，在少數(shù)肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕色顆粒，核仍為藍(lán)色，定位不準(zhǔn)確；④酶修復(fù)，采用復(fù)合消化液修復(fù)肝組織后，細(xì)胞核未被染色；⑤高壓修復(fù)，該法修復(fù)肝組織切片后，染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他修復(fù)法，而且背景清晰；⑥高壓加酶修復(fù)，通過(guò)該法修復(fù)后，肝組織染色強(qiáng)度強(qiáng)，但是組織碎裂，且背景深。LXRβ免疫組化染色結(jié)果見圖2。

3 討 論

甲醛固定時(shí)，蛋白質(zhì)的自由氨基與醛基形成羧甲基，或蛋白質(zhì)氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成醛鍵，使得蛋白質(zhì)抗原決定簇部分被封閉，無(wú)法表達(dá)出來(lái)，影響免疫組化的結(jié)果[1]。抗原決定簇是否充分暴露，是決定免疫組化結(jié)果的關(guān)鍵因素。為了更好地暴露抗原，目前世界公認(rèn)的方法就是進(jìn)行抗原修復(fù)。抗原修復(fù)方法主要包括熱修復(fù)和酶修復(fù)。高溫抗原修復(fù)方法機(jī)理復(fù)雜，高壓可使交聯(lián)斷裂或折疊的肽鏈解開，從而暴露抗原決定簇[2]；微波場(chǎng)內(nèi)離子或極性分子直接碰撞，使扭曲、折疊的異常結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常[3]。熱修復(fù)法比較穩(wěn)定，因高壓修復(fù)法避免了外界環(huán)境對(duì)溫度的影響，在染色強(qiáng)度和重復(fù)性方面優(yōu)于微波修復(fù)法[4]。酶修復(fù)法則是通過(guò)溶解抗原表面的變性蛋白使之暴露，但是酶消化時(shí)間因組織不同而異，不易控制，結(jié)果不穩(wěn)定。在抗原修復(fù)過(guò)程中仍需注意：①抗原修復(fù)液的選擇：在修復(fù)過(guò)程中應(yīng)加入足夠的修復(fù)液防止干片，一般選用檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)，它適用于大多數(shù)抗原，修復(fù)效果佳。②抗原修復(fù)溫度及時(shí)間的選擇：有研究表明，溫度達(dá)到92℃以上才能使甲醛固定的蛋白抗原修復(fù)，一般應(yīng)保持在92℃～98℃。有效溫度持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短應(yīng)因抗原修復(fù)方法不同而不同，一般微波修復(fù)法溫度不好控制，抗原修復(fù)液易沸騰，容易脫片，應(yīng)嚴(yán)密觀察；高壓修復(fù)時(shí)，盛有抗原修復(fù)液的燒杯隔水放在高壓鍋內(nèi)，壓閥噴氣2～4min，溫度容易控制，效果佳。③抗原修復(fù)液應(yīng)自然冷卻：抗原修復(fù)持續(xù)高溫過(guò)后應(yīng)自然降溫，慢慢恢復(fù)蛋白原構(gòu)型。抗原修復(fù)作用廣泛，不僅可以用于免疫組化，尚能用于末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(Tunel)、原位雜交(ISH)和熒光原位雜交(FISH)的檢測(cè)，以及樹脂包埋的半薄和超薄切片的免疫組化檢測(cè)和非交聯(lián)劑固定的活細(xì)胞和細(xì)胞涂片中抗原的檢測(cè)等領(lǐng)域。

本試驗(yàn)嘗試了4種抗原修復(fù)方法，結(jié)果表明在核受體免疫組化中，高壓抗原修復(fù)法結(jié)果穩(wěn)定，優(yōu)于酶修復(fù)法及微波修復(fù)法，染色較強(qiáng)，定位準(zhǔn)確，背景清晰。所以，應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特征，合理選擇抗原修復(fù)方法。