【摘要】目的 觀察IκBα突變型基因對永生化神經前體細胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性細胞因子分泌的影響。方法 在已經建立的轉染pcDNA3.1及轉染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基礎上，用MTT法繪制兩細胞株的生長曲線，用流式細胞儀檢測其增殖指數，以5％小牛血清誘導分化后，采用western blot檢測兩株細胞的分化情況，同時用realtime RT-PCR比較TNF-α、IL-1β和IL-6在兩種細胞株中的表達。 結果 生長曲線及流式細胞儀測得的細胞增殖指數提示：轉染pcDNA3.1/IκBαM INPCs的增殖速度較轉染pcDNA3.1的INPCs明顯降低。經血清誘導分化后，兩者均大量表達膠原纖維酸性蛋白；轉pcDNA3.1/IκBαM的INPCs較轉pcDNA3.1的INPCs IL-1β和IL-6的表達減低，但TNF-α表達變化無顯著性。結論 IκBα突變型基因可減慢INPCs的增殖，并減少部分炎性細胞因子的表達，但對INPCs的分化無顯著影響。

【關鍵詞】干細胞； NF-κB抑制因子α；細胞增殖；細胞分化；細胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain

ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.

【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines

本實驗室成功構建了SV40Tag永生化的大鼠神經前體細胞株（INPCs）[1]，并在此基礎上構建了轉IκBα突變型基因永生化神經前體細胞株。作為細胞移植治療的細胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學特性在轉入外源基因后有何改變，是進一步研究首先應關注的問題。本研究擬通過比較轉IκBα突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細胞因子分泌功能上的差異，為進一步將該轉基因細胞用于細胞移植治療腦缺血等中樞神經系統疾病奠定基礎。

材料與方法

材料 轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本實驗室構建，DMEM/F12培養基、B27無血清培養添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗β-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。

細胞培養及傳代 轉染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養基中，置37℃、5%CO2培養箱培養，0.25％胰酶消化傳代。

細胞生長曲線的繪制 將轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細胞接種12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，繼續培養4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min，在酶標儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。

細胞增殖指數的測定 將轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分別制成單細胞懸液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃預冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的細胞用PBS 洗滌2 次，調整細胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50μg/mL)和RNA酶（終濃度為1μg/ml）， 室溫避光孵育1h后上機檢測，細胞增殖指數= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

Western blot檢測細胞分化 分別提取轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞總蛋白，兩株細胞以5％血清誘導分化一周后分別提取總蛋白，以β-actin為內參照，取等量的蛋白質經10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉至硝酸纖維素膜上， 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10μg/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗β-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯苯胺顯色2～3 min，水洗后照相。

Realtime RT-PCR 檢測細胞因子的表達 用Trizol試劑提取轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRNA進行逆轉錄，然后以逆轉錄產物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進行PCR反應，反應條件為：94℃預變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20s，共反應40個循環后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析細胞因子的的相對表達量[2]，引物列表見表1。

統計學處理采用SPSS 12. 0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（ ±s）表示，不同細胞株間比較采用成組t檢驗，P < 0. 05為差異有統計學意義。

結 果

生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉pcDNA3.1INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第一天外，各時點轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點轉pcDNA3.1 INPCs低，同時點兩株細胞間比較，差異有統計學意義。

流式細胞儀檢測細胞增殖指數 轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞增殖指數依次為61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，兩者比較，差異有統計學意義。

Western blot檢測細胞分化 血清誘導分化后，兩株細胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導分化前，轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2）

細胞因子的表達 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs細胞因子mRNA的相對表達量，如表2所示。將轉pcDNA3.1INPCs相應細胞因子的表達量定義為1，兩株細胞TNF-α的mRNA表達差異無統計學意義，轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表達較轉pcDNA3.1的INPCs低，差異有統計學意義。

討 論

神經前體細胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能[3]。轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培養和傳代證實，轉入IκBα突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實，轉入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導分化后大部分細胞表達作為星形膠質細胞標志的GFAP，分化為星形膠質細胞，僅有少量細胞表達作為神經元標志的MAP2，分化為神經元。增殖和分化潛能的保持即證實了轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神經前體細胞的特性，同時也是該細胞株用于細胞移植治療的基本保證。

NF-κB是廣泛存在于真核細胞內的核轉錄因子，在免疫反應、炎癥、細胞生長、分化、凋亡和癌癥的發生等方面發揮多種重要的生理學功能。國內王劍虹等人的研究證實，IκBα突變型基因轉入肝癌細胞后，可以抑制NF-κB的活性，同時抑制癌細胞的增殖[4]。Widera等人的研究也證實，TNF可通過激活NF-κB促進神經干細胞的增殖，其原理可能與NF-κB激活后，細胞周期蛋白D1上調有關[5]。本實驗也觀察到，轉入IκBα突變型基因后，INPCs生長減慢，細胞增殖指數降低，推測該現象是由于IκBα突變型基因下調NF-κB的活性，使NF-κB下游的一些促細胞增殖的基因也相應下調，減弱了細胞增殖。

一些研究證實，微環境是影響干細胞移植治療效果的重要因素[6] ，細胞因子是微環境的重要成分。INPCs作為細胞移植治療的種子細胞，即受到移植處微環境的影響，同時也通過分泌TNF-α、IL-6 、IL-1β等細胞