作者：鐘興明 鐘依平 齊詮 韋相才

【摘要】 目的：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察酪氨酸酶抑制劑對(duì)生育期雌性大鼠的抗生育效應(yīng)。方法：將90只檢查陰栓為陽(yáng)性的小鼠隨機(jī)分為3組，每組30只。低劑量組每日灌胃大豆異黃酮40mg.kg-1.d-1；高劑量組每日灌胃大豆異黃酮80mg.kg-1.d-1，正常對(duì)照組每日灌胃等量生理鹽水。于D4觀察囊胚和胚胎個(gè)數(shù)，D6觀察著床胚胎數(shù)，D20剖腹檢查活胎數(shù)。結(jié)果：D4正常對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的囊胚發(fā)育率分別為84.8%（106/125），65.63%(84/128)， 62.4%（78/125）。D6正常對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的平均著床胚胎數(shù)分別為5.25個(gè)，1.71個(gè)和1.33個(gè)。D20剖宮取胎，正常對(duì)照組、低劑量組和高劑量組的平均活胎數(shù)分別為4.6個(gè)，0.9個(gè)和0.7個(gè)。3組相比較，正常對(duì)照組的囊胚發(fā)育率、平均著床胚胎數(shù)和平均活胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P＜0.05）。結(jié)論：大豆異黃酮作為一種酪氨酸酶抑制劑，可抑制生育期的雌性小鼠胚泡的發(fā)育和胚胎著床，但具體劑量和機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】 酪氨酸激酶； 大豆異黃酮； 抗著床

酪氨酸激酶（tyrosine protein kinase ，PTKs）是一組酶系，是在正常和異常增殖過(guò)程中起重要作用的癌蛋白和原癌蛋白家族中的成員。多種生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）的受體都有PTKs活性。PTK途徑的激活屬于與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)的信號(hào)途徑。目前，PTK抑制劑在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用主要是抗腫瘤。近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)PTKs的活性與非腫瘤細(xì)胞的生理活動(dòng)有關(guān)，許多PTKs抑制劑能影響正常細(xì)胞的功能和機(jī)能，在這一方面研究較多的是一些發(fā)現(xiàn)較早的天然化合物如染料木黃酮（genistein，GST）、herbimycin A和lavendustin A。大量的研究已證實(shí)，GST在防治癌癥、降低血脂、婦產(chǎn)科的激素替代治療、激素依賴性腫瘤的防治方面有著廣闊的應(yīng)用前景［1］，但對(duì)于抗生育方面的研究較少。本研究通過(guò)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察大豆異黃酮對(duì)青年雌性大鼠生育功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 性成熟期的健康昆明小白鼠，清潔級(jí)，雌性100只，6～8周齡，體重25～30g，連續(xù)觀察兩個(gè)動(dòng)情周期均正常；雄鼠15只，3～4月齡，體重大于30g，雄鼠均采用單籠飼養(yǎng)；喂養(yǎng)顆粒飼料，光照周期12 L:12 d，自由攝食飲水。由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 受試物 大豆異黃酮類(lèi)提取物，由某生物制品公司提供。總的異黃酮含量為22%，其中大豆黃酮9.5%，大豆甙元1.5%，金雀異黃酮10.3%，金雀異黃素(genistein)0.7%，總的游離甙元(有效生物濃度)含量14.4%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用劑量參考徐叔云“藥理實(shí)驗(yàn)方法”計(jì)算［2］。

1.1.3 試劑及儀器 二甲亞楓(dimethylsulfoxide， DMSO)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；實(shí)驗(yàn)用M2囊胚培養(yǎng)液由中山大學(xué)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供(為Sigma產(chǎn)品)。

1.2 試驗(yàn)方法及內(nèi)容

1.2.1 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物中心二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房（溫度20～24℃，濕度40%～70%，12 h明暗交替）單籠飼養(yǎng)適應(yīng)1 w。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 ①雌雄小鼠2∶1合籠，次晨檢查陰栓，陽(yáng)性者定為妊娠第1天，記為D1。其中，100只雌性小鼠中有92只次晨檢查陰栓為陽(yáng)性。隨機(jī)將其中90只分為3組，每組30只。每日上午連續(xù)灌胃相應(yīng)劑量藥物。低劑量組每日灌胃大豆異黃酮40mg.kg-1.d-1；高劑量組每日灌胃大豆異黃酮80mg.kg-1.d-1，按灌胃量為1 ml.150 g-1.d-1配制。正常對(duì)照組每日灌胃等量生理鹽水。于D4下午用頸椎脫臼法每組處死1/3小鼠，取出輸卵管、子宮。自輸卵管傘端及子宮與輸卵管連接處用預(yù)平衡過(guò)夜的M2培養(yǎng)液灌注沖出胚胎，用顯微操作系統(tǒng)中的倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)觀察囊胚形態(tài)學(xué)、統(tǒng)計(jì)胚胎個(gè)數(shù)，計(jì)算囊胚發(fā)育率，留取子宮待檢。②每組的另1/3小鼠于D6用頸椎脫臼法處死，處死前5min從鼠尾注射1%的芝加哥藍(lán)B染液0.1ml，肉眼觀察著床胚胎數(shù)(子宮壁上每出現(xiàn)一條藍(lán)色深帶為一處胚胎著床點(diǎn))，統(tǒng)計(jì)每組著床胚胎總數(shù)及妊娠率［3］。③將每組剩余1/3小鼠繼續(xù)按相同方法喂養(yǎng)，于第20d處死并稱重，剖腹取出子宮和胎鼠，檢查死胎和活胎數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件包建庫(kù)并計(jì)算各組各指標(biāo)的平均值，進(jìn)行均數(shù)和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大豆異黃酮對(duì)胚泡在體內(nèi)發(fā)育的影響

光鏡下，3組共獲取胚胎378個(gè)，其中正常對(duì)照組為125個(gè)，低劑量組為128個(gè)，高劑量組為125個(gè)。3組相比較，獲取胚胎總數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。其中，正常對(duì)照組見(jiàn)106個(gè)胚胎發(fā)育成囊胚，囊胚發(fā)育率為84.8%（106/125）；低劑量組見(jiàn)84個(gè)胚胎發(fā)育成囊胚，囊胚發(fā)育率為65.63%(84/128)；高劑量組見(jiàn)73個(gè)胚胎發(fā)育成囊胚，囊胚發(fā)育率為62.4%（78/125）。3組相比較，正常對(duì)照組的囊胚發(fā)育率較低劑量組和高劑量組顯著增高（P＜0.05），而低劑量組的囊胚發(fā)育率和高劑量組相比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 大豆異黃酮對(duì)胚胎著床的影響

3組共獲得孕鼠18只。其中正常對(duì)照組8只，妊娠率為80%；低劑量組為7只，妊娠率為60%；高劑量組為3只，妊娠率為30%。3組相比較，高劑量組的妊娠率顯著低于正常對(duì)照組和低劑量組（P＜0.05）。正常對(duì)照組和低劑量組的妊娠率相比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。3組共獲得的著床胚胎總數(shù)為58個(gè)，其中正常對(duì)照組為42個(gè)，平均著床胚胎數(shù)為5.25個(gè)；低劑量組著床胚胎總數(shù)為12個(gè)，平均著床胚胎數(shù)為1.71個(gè)；高劑量組著床胚胎總數(shù)為4個(gè)，平均著床胚胎數(shù)為1.33個(gè)。3組相比較，正常對(duì)照組的著床胚胎總數(shù)和平均著床胚胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P＜0.05）。

2.3 大豆異黃酮對(duì)胎鼠的影響

剖宮取胎后共獲得活胎62個(gè)，均未見(jiàn)死胎和畸胎。其中正常對(duì)照組為46個(gè)，平均活胎數(shù)為4.6個(gè)，低劑量組為9只，平均活胎數(shù)為0.9個(gè)，高劑量組為7只，平均活胎數(shù)為0.7只。3組相比較，正常對(duì)照組的活胎總數(shù)和平均活胎數(shù)顯著高于低劑量組和高劑量組（P＜0.01）。

3 討論

大豆異黃酮是一種黃酮類(lèi)的PTKS抑制劑，其中包含大豆黃酮、大豆甙元、金雀異黃酮和金雀異黃素（genistein）等。國(guó)內(nèi)研究表明，大豆異黃酮提取物對(duì)酪氨酸酶活性有比較強(qiáng)的抑制作用，并且隨著大豆異黃酮提取物濃度的提高，其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率也提高［4］。Genistein是ATP與PTK結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能有效地抑制EGF酪氨酸激酶。現(xiàn)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在黃體細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，應(yīng)用PTK抑制劑不僅可明顯拮抗EGF升高孕酮的作用，而且在小鼠的胚泡體外發(fā)育和胚胎移植的過(guò)程中可明顯抑制胚胎著床［5］。另外，從結(jié)構(gòu)上講，genistein屬于一種植物雌激素［6］，既能代替雌激素和ER結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用，又能干擾雌激素和ER結(jié)合，表現(xiàn)抗雌激素作用，具有雙向性。Dechaud H研究發(fā)現(xiàn)，genistein可以與3H標(biāo)記的雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合性激素型球蛋白，從而干擾雌激素與其受體結(jié)合，破壞體內(nèi)的激素平衡。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物攝入過(guò)量的植物雌激素，能干擾促性腺激素釋放的反饋系統(tǒng)，導(dǎo)致生育問(wèn)題［7］。近年來(lái)對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)胚泡著床的研究表明，著床期子宮內(nèi)膜也需要基礎(chǔ)水平的雌激素，而且孕激素受體的表達(dá)有賴于雌激素的誘導(dǎo)，因此利用小劑量genistein的抗雌激素作為抗著床的可能性是存在的。趙更力［8］的研究表明，應(yīng)用大豆異黃酮后，內(nèi)膜表現(xiàn)出不同程度的增生、子宮重量明顯增加，而且子宮重量系數(shù)和內(nèi)膜增生程度與大豆異黃酮的劑量有關(guān)，表明大豆異黃酮具有雌激素樣作用并且作用強(qiáng)度與劑量有關(guān)，大劑量大豆異黃酮引起子宮內(nèi)膜的增生反應(yīng)明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在喂養(yǎng)不同劑量的大豆異黃酮后，D4獲取的胚胎總數(shù)和囊胚的發(fā)育率較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；D6獲得的胚胎著床數(shù)和平均著床胚胎數(shù)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；D20獲得的活胎總數(shù)和平均活胎數(shù)也較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01）。說(shuō)明大豆異黃酮對(duì)生育期雌性小鼠存在著明顯的抗生育效應(yīng)。遲曉星等［9］認(rèn)為大豆異黃酮對(duì)青年雌性大鼠體質(zhì)量的影響不顯著，但高劑量組大鼠的卵巢發(fā)生了病理變化，主要表現(xiàn)為卵泡增多，體積增大，卵泡內(nèi)顆粒層細(xì)胞增多，厚度增加，卵泡液豐富。推測(cè)在300 mg/kg·bw的劑量下，大豆異黃酮可能會(huì)對(duì)青年雌性大鼠卵巢產(chǎn)生影響。Genistein與E2一樣，在低濃度時(shí)促進(jìn)黃體酮的合成，高濃度時(shí)則抑制其合成［10］。Genistein對(duì)于年輕動(dòng)物、雌激素化的動(dòng)物及年輕婦女等高雌激素水平者，表現(xiàn)為抗雌激素活性，而在E2較低的自然絕經(jīng)和手術(shù)絕經(jīng)的婦女則顯示雌激素樣作用［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，青年婦女每天服用異黃酮45mg，月經(jīng)周期推遲1.5天，卵泡相延長(zhǎng)2.5天，黃體相縮短1天。因而，從理論上推測(cè)genistein作為PTKS抑制劑一方面可干擾著床時(shí)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，破壞蛻膜組織的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡；另一方面對(duì)體內(nèi)高雌激素水平的生育期雌性小鼠還具有抗雌激素作用，故其具有抗著床作用。本研究結(jié)果還顯示，大豆異黃酮雖可抑制胚泡發(fā)育和胚胎著床，但對(duì)于著床后的胚胎發(fā)育卻無(wú)明顯影響，剖宮取胎未發(fā)現(xiàn)死胎或畸胎。綜上所述，大豆異黃酮作為黃酮類(lèi)的PTKS抑制劑，對(duì)生育期雌性小鼠具有一定的抗生育作用。但具體的抗著床劑量及機(jī)制，還需進(jìn)行更深入的研究，為新型避孕藥物的研究及開(kāi)發(fā)提供理論及實(shí)驗(yàn)支持。