作者：張鈺， 李軼杰， 馬正海， 陳璇， 潘曉燕， 張富春

【摘要】 目的: 探討分枝桿菌熱休克蛋白（HSP70）對草原兔尾鼠卵透明帶3（LZP3）免疫不育效果的增強作用。方法: 將HSP70全長和C端分別與LZP3融合構建pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C重組質粒， 同時與具有免疫不育功能的pcD-L和pcD-ACLC一起分別免疫NIH小鼠， 分別檢測重組質粒在機體真核細胞中的表達情況、 T細胞增殖及體液免疫水平、 抗生育效果、 卵巢的病理變化和免疫熒光定位。結果: LZP3構建的重組質粒均能在小鼠肝臟中表達; 免疫后能刺激機體T細胞增殖， 尤其是pcD-ACLC和 pcD-L-HSP70C免疫組（P<0.01）; 同時激發機體產生特異性抗體（P<0.05）; 除pcD-L-HSP70免疫組外其他3種重組質粒均具有抗生育效果（P<0.05）， 且 pcD-ACLC和pcD-L-HSP70C極明顯地降低了小鼠平均窩仔數（P<0.01）且未引發機體產生卵巢炎; 直接免疫熒光結果表明在綠色激發光下小鼠卵母細胞的卵透明帶均能發出綠色熒光。結論: 與pcD-L-HSP70免疫相比， pcD-L-HSP70C能明顯地降低小鼠平均窩仔數， 這表明分枝桿菌熱休克蛋白HSP70C端對增強LZP3免疫不育效果具有明顯的基因佐劑功效。

【關鍵詞】 草原兔尾鼠卵透明帶3 免疫不育 HSP70 融合佐劑

［Abstract］ AIM: To investigate the immunocontraceptive effect of Lagurus lagurus zona pellucida 3 gene (LZP3) fused by Mycobacterium tuberculosis HSP70 and C-terminal of HSP70. METHODS: Two immunocontractive recombinant plasmids pcD-L-HSP70 and pcD-L-HSP70C were constructed using LZP3. Meanwhile， pcD-L and pcD-ACLC which were effective immunocontraceptive vaccines were studied as control. RESULTS: After the LZP3 genes were expressed in the livers of mice with the introduction of hydrnamic transfection instead of traditional HeLa cell transfection by RT-PCR， NIH mice were immunized with ZP3 DNA vaccines. The results of ELISA showed that all of the recombinants in mice elicited specific anti-ZP3 antibodies which were combined with the ZP3 of oocytes from the immunized mice in immunofluorescence assay. MTS assay showed that the lymphocytes in all groups were proliferated by stimulating the recombinant LZP3 with no disruption of follicular in ovaries， especially those in groups of pcD-ACLC and pcD-L-HSP70C (P<0.01). Antifertility experiments showed that three groups (besides pcD-L-HSP70) enhanced the sterile effects (P<0.05)， especially those in the groups of pcD-ACLC and pcD-L-HSP70C (P<0.01). CONCLUSION: LZP3 fused by the C-terminal of mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 had a good immunocontraceptive effect while LZP3 fused by Mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 had a poor effect on birth control. So the C-terminal of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein HSP70 might be a better candidate to deliver the adjuvant function in LZP3 DNA immunocontraceptive vaccination than the complete HSP70 molecule.

［Keywords］Lagurus lagurus zona pellucida 3 (LZP3); antifertility; HSP70; fusioned adjuvant

哺乳動物的卵透明帶（zona pellucida， ZP）一般由ZP1、 ZP2和ZP3（或ZPA、 ZPB、 ZPC） 3種糖蛋白組成， 其中ZP3含有精子初級受體， 是精卵結合過程中精子必須穿過的障礙。大量研究表明， 阻斷精子與ZP3的結合就可以阻斷小鼠、 豬等的生殖過程， 從而實現控制哺乳動物的種群和數量［1， 2］。因此ZP3是利用免疫不育技術控制有害哺乳動物的理想靶抗原。熱休克蛋白(HSP)是一些進化上非常保守的蛋白質家族分子， 其中HSP70家族是HSP中最大的一族， 能與相對分子質量(Mr)差異很大的蛋白質和多肽結合， 直接作用于免疫系統上的HSP70受體， 很大程度提呈目的基因的表達產物［3］; 另一方面HSP70具有交叉提呈作用［4］， 將其與ZP3融合可能會避免DNA疫苗引發的自身免疫性卵巢炎。HSP70C 端具有刺激產生CC趨化因子、 IL-12、 TNF-α、 NO和促使DC細胞成熟及T細胞向Th1型極化發展的作用， 是HSP70中真正行使佐劑功能的區域［5］。因此本研究中將草原兔尾鼠卵透明帶3（Lagurus lagurus zona pellucida 3， LZP3）基因與 HSP70及HSP70C 端序列分別融合、 構建DNA疫苗pcD-L-HSP70 和pcD-L-HSP70C， 同時與具有免疫不育功效的重組DNA疫苗pcD-L和pcD-ACLC［2］分別免疫小鼠， 比較抗生育效果， 探究HSP70C端對免疫不育效果的影響， 為研制高效的DNA不育疫苗奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 重組質粒pcDNA3-LZP3（pcD-L）、 pcDNA3-aat-comp-LZP3-C3d3（pcD-ACLC）、 pcDNA3- LZP3-HSP70（pcD-L-HSP70）和pcDNA3-LZP3-HSP70（C）（pcD-L-HSP70C）由本實驗室構建; 4~6周齡雌性NIH小鼠購自新疆醫科大學動物實驗中心; 引物及相關測序均由北京奧科生物公司提供完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建、 鑒定及純化 設計帶有連接子（G-S-G-G-S）3的融合引物［6］ LZP3-HSP70(N) p1(n) 5′-aatgaattcatgtgtgccctgcctctgtg-3′; p2(n): 5′-aatggatccagaaccgccagatccagagccaccccagccctccacagcct-3′; p3(n): 5′-aatggatccggtggctctggatctgctcgtgcggtcgggatc-3′; LZP3-HSP70(c) p3(c): 5′aatggatccggtggctctggatctatccaggaaggctcgggc-3′; p4(c): 5′-aatctcgagtcacttggcctcccggcc-3′。PCR分別擴增LZP3、 HSP70和HSP70C端。用EcoR I/BamH I酶切純化的LZP3， BamH I/Xho I酶切純化的HSP70和HSP70C， 然后將其與EcoR I/Xho I酶切的pcDNA3進行連接， 構建成重組質粒pcD-L-HSP70和pcD-L-HSP70C， PCR、 酶切和測序鑒定重組質粒正確性后用PEG8000純化質粒， HITACHI UV3010檢測質粒的純度及含量， 然后用生理鹽水調整質粒的終濃度至1 g/L。

1.2.2 重組質粒在體內真核細胞中的瞬時表達檢測 按照水動力體內轉染真核細胞學說［7］， 將溶有重組質粒的2.5 mL生理鹽水， 快速注入小鼠尾靜脈8 h后提取小鼠肝臟， RT-PCR檢測目的基因的表達情況。

1.2.3 DNA疫苗免疫 隨機將實驗小鼠分為7組， 每組9只， 于小鼠后腿脛骨前肌預免5 mL/L普魯卡因100 μL， 24 h后在同一部位多點注射質粒DNA 100 μL（質粒含量1 g/L）， 2周后免疫加強。加強前于小鼠眼眶靜脈叢取血， 收集血清， -20℃備用。

1.2.4 T細胞增殖實驗 采用常規的MTS檢測方法， 分別用ConA、 BSA、 GST-LZP3刺激脾臟單細胞懸液（1×106）， 每組設3個重復。以刺激指數（SI=各刺激組的A值/未加刺激物組A值）測定小鼠淋巴細胞的增殖能力。

1.2.5 免疫小鼠抗血清的ELISA檢測 采用間接ELISA法， 以純化GST-LZP3融合蛋白作為標準抗原蛋白， 以-20℃凍存血清作為一抗， 羊抗鼠IgG作為二抗，酶標儀檢測各孔A450/655值。

1.2.6 小鼠抗生育實驗 將免疫80 d后的NIH雌鼠與具有生育能力的未免疫雄鼠進行1∶1合籠， 第2天檢測陰栓， 檢測到的分籠喂養， 20~23 d后計算生仔數。

1.2.7 小鼠卵巢組織學檢測 將鼠卵巢組織取出后用40 g/L多聚甲醛固定， 脫水透明， 石蠟包埋， 修塊切片后做HE染色，與生理鹽水、 pcDNA3、 pcDNA3-HSP70組作為對照進行分析比較。

1.2.8 小鼠卵母細胞的免疫熒光檢測 將非發情期的實驗鼠分別腹腔注射PMSG（10萬U/只）， HCG（10萬U/只）， 14~15 h后處死小鼠， 收集卵丘卵母細胞復合體（COC）。透明質酸酶消化后將單個成熟的卵母細胞置于載玻片上， 固定， 封閉， 以-20℃凍存的血清作為一抗， FITC標記的羊抗小鼠IgG作為二抗， 甘油緩沖液封存后在倒置顯微鏡下觀察、 照相。

2 結果

2.1 重組質粒的構建及鑒定 將真核表達載體pcDNA3和另外5種重組質粒載體分別進行限制性內切酶酶切和PCR檢測。電泳結果顯示: pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC的酶切和PCR均得到1100 bp左右的LZP3; pcD-HSP70和pcD-L-HSP70的酶切和PCR均得到1900 bp左右的HSP70全長; 而pcD-L-HSP70C的酶切和PCR則得到500 bp左右的HSP70C端; pcD-ACLC經3種酶Hind III/Xho I/Xba I作用后還得到1條2700 bp左右的條帶， 這是3分子的C3d。從酶切和PCR結果初步推測重組質粒構建正確， 測序結果再次證明重組質粒的正確性（圖1）。

圖1 重組質粒的酶切和PCR鑒定（略）

Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis and PCR of recombinant plasmids

1: Negative control of PCR; 2， 13， 16: DL 15000 marker; 3: pcDNA3 pcDNA3 digested by Hind III/Xho I; 4: PCR of pcDNA3; 5: pcDNA3-LZP3 pcDNA3 digested by Hind III/Xho I; 6: PCR of pcDNA3-LZP3; 7: pcDNA3-HSP70 digested by Hind III/Xho I; 8: PCR of pcDNA3-HSP70; 9: pcDNA3-LZP3-HSP70 digested by Hind III/BamH I/Xho I; 10: PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70; 11: pcDNA3-LZP3-HSP70(C) digested by Hind III/BamH I/Xho I; 12: PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70(C); 14: PCR of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 15: pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3 digested by Hind III/Xho I/Xba I.

2.2 重組質粒在機體真核細胞中表達的RT-PCR檢測 提取小鼠肝臟總RNA， 然后將其反轉錄的cDNA作為模板， 用LZP3核心引物和HSP70引物分別擴增目的條帶， 結果表明幾種重組質粒均能在小鼠肝臟中瞬時表達， 這說明目的基因可以在真核細胞中進行mRNA水平上的表達（圖2）。

圖2 水動力技術檢測重組質粒在小鼠體內的真核表達（略）

Fig 2 The results of plasmids RT-PCR with the Hydrodynamics-based delivery in mouse liver cells

1: Negative control of PCR; 2， 13: DL 2000 marker; 3: RT-PCR of pcDNA3; 4: PCR of the whole RNA of pcDNA3; 5: RT-PCR of pcDNA3-HSP70; 6: PCR of the whole RNA of pcDNA3-HSP70; 7: RT-PCR of pcDNA3-LZP3; 8: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3; 9: RT-PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70; 10: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3-HSP70; 11: RT-PCR of pcDNA3-LZP3-HSP70c; 12: PCR of the whole RNA of pcDNA3-LZP3-HSP70c; 14: RT-PCR of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 15: PCR of the whole RNA of pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3; 16: DL 15000+2000 marker.

2.3 DNA疫苗免疫小鼠的T淋巴細胞增殖反應 淋巴細胞增殖刺激指數結果表明， 與對照相比， pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC免疫組均能誘導很強的特異性淋巴細胞增殖反應， 其中pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC實驗組的增殖效果有統計學意義（P<0.01）， 說明重組質粒在小鼠體內可以激發特異性的細胞免疫反應。

2.4 免疫血清中特異性抗體的ELISA檢測 ELISA檢測結果顯示重組質粒免疫組在第1次免疫后血清中都出現了特異性抗體， 隨著免疫次數的增加， 血清中抗體水平均呈上升趨勢。與對照組pcDNA3相比， 除pcD-L-HSP70組差異有統計學意義（P<0.05）外， 其他3組都極明顯地提高特異性抗體水平（P<0.01）。

2.5 抗生育結果 SPSS軟件分析抗生育結果表明: 和對照組相比， pcD-L、 pcD-L-HSP70、 pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC 4種重組質粒均能使雌性小鼠平均窩仔數下降， pcD-L免疫組的平均窩仔數明顯減少（P<0.05）， pcD-L-HSP70C和pcD-ACLC免疫組的平均窩仔數極明顯地減少（P<0.01）， 但2組之間的平均窩仔數沒有明顯差異; 而pcD-L-HSP70免疫組的平均窩仔數減少不明顯， 無統計學意義（P>0.05）。

2.6 小鼠卵巢組織病理學切片檢測 小鼠卵巢組織石蠟切片經蘇木素-伊紅（HE）染色后， 與正常小鼠和對照組小鼠卵巢結構相比: 免疫組小鼠卵巢結構無明顯病理變化， 均存在各個發育階段的卵母細胞， 黃體也未出現異常膨大及細胞內和細胞間的炎癥反應現象（圖3）。2.7 小鼠成熟卵母細胞的免疫熒光檢測 將超排小鼠的成熟卵母細胞固定到載玻片上進行直接和間接免疫熒光檢驗， 結果發現: 無論是間接免疫熒光還是直接免疫熒光， 在綠色激發光下， 小鼠的卵透明帶上均能被激發出綠色熒光（圖4）。

3 討論 在DNA疫苗的發展進程中， 選擇合適的佐劑與選擇目的基因本身同樣重要， 本研究中我們將HSP70與抗生育基因LZP3融合探討其對免疫不育效果的影響。HSP70是一種很好的廣譜免疫佐劑， 然而一些研究表明HSP70存在一定的局限性， 相比之下HSP70C端具有更好的免疫佐劑功能。葛菲菲等［8］發現融合HSP70全長雖使IL-2的水平及T細胞增殖有所提高和增強， 但效果遠不及融合HSP70C端免疫組明顯， 推測可能是由于抗原提呈細胞(APC)表面受體與HSP70結合區域集中在肽連接區， 而ATP酶區有抑制IL-10和TGF-α產生的作用， 且HSP70會掩蓋某些抗原表位， 從而降低了HSP70全長載體分子效應， 而HSP70肽連接區則體現了明顯的佐劑優勢［9］。隨后， Li等［10］同樣發現融合HSP70C端(359~610)的DNA疫苗不僅能明顯地提高HBsAg的特異性CTL水平， 而且能夠克服Ld限制性抗原決定簇所造成的抑制作用， 同時還可高效清除機體循環系統中的HBsAg， 大大下調HBV的復制， 而融合HSP70N端及全長的DNA疫苗卻無此功用， 認為這也與HSP70359~610具有Th1樣細胞因子和CC趨化因子功能有關。Cardozo等［11］進一步表明HSP70C端能和蛋白酶體作用形成一個指環樣的“U”型結構， 這種由十肽重復序列組成的結構廣泛存在于泛素連接酶中， 它可使HSP70C 端融合的目的基因被精確降解， 進而被胞吞和高效提呈。基于上述原因， 本研究采用15個小分子氨基酸即（G-S-G-G-S）3作為連接子將不育基因（LZP3）和HSP70C端進行融合表達， 為HSP70C和LZP3目的蛋白的正確折疊提供更為廣闊充分的三維空間結構來增強免疫效果［9］。結果表明pcD-L-HSP70C免疫組與pcD-L-HSP70相比極明顯地激發機體產生特異性的LZP3抗體水平和T細胞增殖能力， 表明HSP70C端功能相對不明區對增強LZP3的免疫不育具有佐劑增強的生物學功能， 且極明顯地降低小鼠平均窩仔數， 實現了預期避免機體卵巢炎發生的目的， 為篩選高效安全的DNA不育疫苗控制草原兔尾鼠免疫不育的研究和應用提供了可靠的理論基礎。

圖3 免疫小鼠卵巢組織病理切片檢測 （略）

Fig 3 Histology of 4 μm ovarian sections from DNA vaccines immunized mice

A: Non-immunized mice; B: Mice intramuscularly immunized with 90 mL/L saline; C: Mice intramuscularly immunized with pcDNA3.0; D: Mice intramuscularly immunized with pcDNA3-HSP70; E: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3; F: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3-HSP70; G: Mice orally immunized with pcDNA3-LZP3-HSP70c; H: Mice orally immunized with pcDNA3-Aat-Comp-LZP3-C3d3.

圖4 小鼠卵母細胞的直接和間接免疫熒光檢測（略）

Fig 4 Immunofluorescence detection of direction and indirection of oocytes

A: Detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; B: Direction immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; C: Detection of oocytes from mice immunised by pcDNA3-LZP3-HSP70 in transfer light（×200）; D: Direction immunofluorescence detection of oocytes from mice immunised by pcDNA3-LZP3-HSP70（×200）; E: Detection of oocytes from control mice in transfer light（×100）; F: Indirection immunofluorescence detection of oocytes from control mice（×100）; G: Detection of oocytes from pcDNA3-LZP3-HSP70(c) mice in transfer light（×100）; H: Direction immunofluorescence detection of oocytes from pcDNA3-LZP3-HSP70c mice（×100）.