作 者：張兵，竇志華，羅 琳，達坤林，尤蝠儀，曹衛菊

【摘要】 目的：建立復方五仁醇膠囊血清藥理學研究方法。方法：建立CCl4誘導的原代培養大鼠肝細胞損傷模型，大鼠為含藥血清供體，以含藥血清對損傷肝細胞增殖（MTT法）及丙氨酸氨基轉移酶（ALT）泄漏的影響兩個指標，結合含藥血清中五味子乙素的含量測定，分別采用單因素考察、多因素的正交試驗，優選含藥血清的制備方法，并確定體系中血清添加量。結果：每天以成人等效劑量10倍的甲醇提取物間隔8h分兩次給正常大鼠灌胃給藥，連續3天，末次給藥后2h采血制備含藥血清比較合理，體系中加入10%該條件下制備的含藥血清能明顯提高損傷肝細胞的增殖能力、降低細胞ALT泄漏。結論：適宜條件下制備的復方五仁醇膠囊含藥血清對肝細胞損傷具有明顯的保護作用，血清藥理學研究方法可以用于該制劑的藥效評價。

【關鍵詞】 復方五仁醇膠囊；保肝作用；含藥血清；血清藥理學

[Abstract] Objective：To establish a serum pharmacology testing method for compound wurenchun capsules (CWC). Methods：Model of CCl4-induced injury of primary culture hepatocyte was established and rat was used as the donor to prepare serum containing CWC. With hepatocyte increment(MTT)， alanine aminotransferase(ALT) in cell culture medium and the content of schisandrin in serum as indices， single-factor investigation and multiple-factor orthogonal experiment were carried out， using serum or plasma， and serum containing drug in culture system of different concentration on pharmacological effect and to screen of the preparative method of serum containing drug and its suitable concentration in culture system. Results：Normal rats as the donator of serum， using methanolic extract of CWC， 10 times equivalent dose for adults every day， intragastric administration twice a day of 8-hour interval， keeping on 3 days， hemospasia after 2 hours of the last administration was the better preparative method of the serum containing drug. Adding 10% of this serum to culture system could elevate hepatocyte increment and depress ALT in cell culture medium significantly. Conclusion：Serum containing CWC prepared by suitable method possesses an obvious protective effect on injured hepatocyte and serum pharmacology can be applied to evaluated the pharmacological effect of CWC.

[Key words] Compound wurenchun capsules (CWC); Liver protection; Serum containing drug; Serum pharmacology

中藥“血清藥理學”是指在動物經口服給藥一段時間后采血分離血清，用此含藥血清進行體外藥理實驗的一種實驗方法，該方法作為中藥研究的新思路和新方法而倍受推崇。復方五仁醇膠囊是我院研制的以五味子為君藥的治療慢性肝炎的科研制劑，我們對該制劑進行了“血清藥理學”研究的方法學探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，SPF級，體重230±19.8 g，雌雄不拘，由南通大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑與試藥 羥乙基哌嗪乙磺酸（香港FARCO公司）；乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸（美國AMRESCO公司分裝）；膠原酶IV（美國Sigma公司分裝）；胰蛋白酶（美國Sigma公司分裝）；DMEM培養基（美國GIBCO公司）；新西蘭新生小牛血清（美國HyClone公司）；四氯化碳（宜興市第二化學試劑廠）；溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑藍（MTT，AMRESCO公司）；五味子乙素（中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心）；復方五仁醇膠囊（本院自制）。

1.1.3 儀器 HERA cell CO2培養箱（德國GmbH公司）；BIO-TEK340酶標儀（美國Sigma公司）；日立7170全自動生化分析儀（日本日立公司）；Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠灌胃用藥物的處理 取復方五仁醇膠囊內容物，加0.5%CMC-Na制成混懸液。另取復方五仁醇膠囊內容物，甲醇回流提取，加0.5%CMC-Na制成混懸液。

1.2.2 肝細胞的分離與培養 按文獻[1]方法分離大鼠肝細胞，并以1×105/cm2接種于96孔及48孔培養板中，置CO2培養箱（5％CO2）37℃培養。

1.2.3 含藥血清制備方法考察Ⅰ 給藥形式及劑量考察取SD大鼠20只，隨機分成5組（制劑原形組，提取物小劑量、中劑量、大劑量組和空白組），每組4只，禁食12 h。制劑原組組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃制劑混懸液，提取物小劑量、中劑量和大劑量組同法分別灌胃5、10和20的提取物混懸液，連續給藥3天，末次給藥后1 h頸總動脈取血，4℃過夜，分離血清，空白組每天0.5%CMC-Na 灌胃，同法制備空白血清。

取培養24小時的肝細胞，吸棄上清液，隨機分成6組（正常對照組，模型對照組，制劑原形組，提取物小劑量、中劑量、大劑量組），每組設6個復孔。除正常對照組外，每孔加入含CCl4的DMEM及相應含藥血清（模型對照組為空白血清），CCl4和血清的終濃度分別為10 mmol/L和10％，正常組相應加入DMEM培養液和空白血清。作用24 h后，收集48孔板中培養上清液檢測ALT。96孔板中每孔加入5 mg/ml的MTT液20 μl，繼續孵育4h，每孔再加入DMSO 200 μl，振蕩后，用酶標儀于波長570 nm測吸光值A。

1.2.4 含藥血清制備方法考察Ⅱ 其他條件的正交試驗考察 以動物是否造模、給藥間隔時間、取血時間、取血成分為考察因素，每個因素設2個水平（見表1），選用L8(27)正交表安排試驗。取SD大鼠32只，隨機分成8組，每組4只，其中肝損傷模型大鼠給藥前24 h腹腔注射CCl4 1.0 ml/kg。各組每天按照成人臨床等效劑量的10倍分兩次灌胃提取物混懸液，末次頸總動脈取血，血漿組血液立即離心分離血漿，血清組血液4℃過夜，分離血清。

取培養24 h的肝細胞，吸棄上清液，隨機分成8組，分別用以上制得的含藥血清（血漿）按1.2.3相應方法處理，測定ALT及吸光值A。

按文獻方法[2]制備對照品及含藥血清（血漿）供試品溶液，注入液相色譜儀，測定五味子乙素含量。

1.2.5 體系中含藥血清添加量考察 取培養24h的肝細胞，棄上清液，隨機分成6組（正常對照組，模型對照組，5%、10%、20%、40%含藥血清組），每組設6個復孔。模型對照組和各含藥血清組更換為加入CCl4 10 mmol/L的DMEM培養液，正常對照組相應加入DMEM培養基，正常對照組和模型對照組加入終濃度為10％的空白血清，各含藥血清分別組加入按1.2.4中正交試驗1號方案制備的含藥血清，使終濃度分別為5%、10%、20%和40%。作用24 h后，按1.2.3相應方法處理，測定ALT及吸光值A。

1.2.6 統計學方法 使用Stata7.0統計軟件包進行數據處理。數據以x±s表示，用方差分析處理數據。

2 結 果

2.1 含藥血清制備方法考察Ⅰ：給藥形式及劑量考察 與正常對照組相比，模型對照組MTT值顯著下降（P<0.01）、ALT顯著升高（P<0.01），說明造模獲得成功；與模型對照組比較，除提取物小劑量組MTT值無顯著差異外（P>0.05），其余各試驗組MTT值均明顯升高（P<0.01或P<0.05），ALT明顯下降（P<0.01或P<0.05）；與提取物中劑量組比較，等劑量灌胃制備的制劑原形組MTT值及ALT差異均無統計學意義（P>0.05）。結果提示，制劑的甲醇提取物與制劑原形具有等效性，且3個劑量組不存在明顯的量效關系。故確定以成人臨床等效劑量10倍的甲醇提取物給大鼠灌胃制備含藥血清。見表2。

2.2 含藥血清制備方法考察Ⅱ：其他條件的正交試驗考察 將各試驗組3個指標的測定結果分別按百分制轉換成積分（MTT、五味子乙素以最高為100，ALT以倒數計算，最高為100），綜合加權評分（MTT、ALT、五味子乙素分別占35%、35%和30%）后進行統計分析。結果見表3。

方差分析結果顯示，C因素（取血時間）對結果有極顯著影響（P<0.01），B因素（給藥間隔時間）有顯著影響（P<0.05），且兩者之間存在交互作用（B×C之P<0.05，交互作用分析顯示最佳組合為B1C1），血漿的影響優于血清，但無統計學意義（P>0.05），而動物是否造模幾乎沒有影響（見表4）。

因此，含藥血清制備方法可定為A1B1C1D1，即每天間隔8 h給正常大鼠灌胃給藥2次，連續3天，末次給藥后2 h取血分離血清。

2.3 體系中含藥血清添加量考察 與模型對照組比較，各濃度含藥血清組MTT值均明顯升高（P<0.01或P<0.05），ALT均顯著下降（P<0.01）；與10%含藥血清組比較，20%、40%含藥血清組MTT值明顯下降（P<0.01或P<0.05），5%含藥血清組無顯著差異（P>0.05），5%、20%、40%含藥血清組ALT均明顯升高（P<0.01或P<0.05）。提示體系中加入10%的含藥血清效果最佳（見表5）。

3 討 論

目前含藥血清的制備多數采用藥效指標考察，少數考慮化學指標，且忽視了各影響因素的交互作用。本課題采用藥理和化學指標相結合加權評分的正交試驗，發現存在交互作用。

理論上講，宜采用病理狀態下的動物制備含藥血清[3]，但是，本研究結果顯示，動物是否造模幾乎對結果沒有影響，與文獻報道一致[4]。

有學者提出“血漿藥理學”優于“血清藥理學”[5]，本研究結果顯示，血漿與血清對結果的影響雖然沒有統計學差異，但直觀分析前者優于后者，與先期發現的血漿中藥效成分含量高于血清的結果[2]一致，后續研究應該注意。

研究結果顯示，含藥血清濃度超過一定范圍藥效反而降低，這可能是由于血清濃度過高會產生一定的細胞毒性[6]。

【參考文獻】 [1] 徐淑云. 藥理實驗方法學[M]. 第3版. 北京：人民衛生出版社，2002：581-583. [2] 羅 琳，竇志華，丁安偉，等． 大鼠灌胃復方五仁醇膠囊后血清和血漿中五味子醇甲和五味子乙素的比較[J]．中草藥，2006，37（10）：1486-1489. [3] 張聲鵬，施旭光，桂蜀華．關于中藥血清藥理學中血清供體動物是否造模的思考[J]．中國西醫結合">中西醫結合雜志，2001，21（5）：388-389. [4] 陰赪宏，李蘭芳，金亞宏，等．當歸補血湯肝損傷小鼠含藥血清抑制肝組織LPO生成的作用[J]．中國實驗方劑學雜志，2000，6（5）：32-34. [5] 賀石林，葛金文，賀 蓉，等．質疑血清藥理學，加強多層次半體內實驗研究[J]．中國藥理學通報，2005，21（3）：277-279. [6] 王 霖，張 云，汪受傳．中藥血清藥理學研究中含藥血清添加量問題的商榷[J]．山西中醫，2006，22（1）：51-52.