【摘要】 目的 檢測肝細胞癌異質性亞群細胞對化療藥物的耐藥差異，探討耐藥蛋白在肝癌組織中不同亞群細胞的表達意義。方法 ①通過MTT法分別測定人肝細胞癌異質性亞群細胞在不同濃度、不同化療藥物（ADM、VP-16、DDP）作用下的抑制率，計算每種藥物IC50值。② 應用流式細胞儀分別檢測耐藥相關蛋白MDR1、MRP、LRP、GST在兩亞群細胞中的表達率。結果 ①LCSC-1和LCSC-2亞群細胞對阿霉素（ADM）、順鉑（DDP）、鬼臼乙叉苷(VP-16)等藥物都產生了耐藥性（F＝249.651）。三種藥物對LCSC-2亞群細胞和LCSC-1亞群細胞抑制率有顯著差異 (P<0 .01)。②LCSC-1和LCSC-1亞群細胞MDR1、MRP、LRP、GST的表達量分別是：（23.97± 0.34）% 、（17.03±0.59）% 、（24.02±0.63）% 、（23.93± 0.59）% ；（26.59± 0.78）% 、（19.43± 0.60）% 、（26.43±1.06）% 、（26.24±1.06）% ；兩亞群比較，t=5.32 ，P=0.006；t=4.94 ，P=0.008；t=3.85，P=0.028；t=3.30，P=0.030。兩亞群細胞MDR1、MRP、LRP、GST的表達有顯著性差異。結論 MRP、LRP、GST、MDR1的高表達，可能是人肝癌細胞異質性亞群多耐藥產生的部分分子基礎，耐藥是肝細胞癌干細胞的特征之一。

【關鍵詞】 肝細胞癌 異質性亞群細胞 多藥耐藥

Abstract Objective To study the expression and significance of multidrug resistance-associated protein in human HCC heterogeneous subpopulations cells. Methods ①Resistance of subpopulations cells (LCSC-1 and LCSC-2) to different chemotherapeutic drugs (ADM， VP-16， and DDP) and the IC50 values of each drug are measured using MTT method. ②Number of positive cells of MDR1， MRP， LRP， GST related to drug resistance are measured using flow cytometry， and the average level of expression of drug-resistant proteins of each subpopulations cells is calculated. Results ①Both subpopulations showed resistance against ADM， DDP， and VP-16.The IC50 values of these drugs to LCSC-2 are higher than those to LSCS-1(F=249.651).This result suggests a higher drug resistance of LCSC-2 subpopulation (P<0 .01). According to the results of statistical analysis， the inhibition rate of three drugs against LCSC-2 and LCSC-1 showed significant difference (P<0.01). ②The expression of MDR1 and MRP of LSCS-2 is significantly higher than that of LCSC-1 (P<0.01). A significantly difference of expression of LRP and GST is also observed (P<0.05). MDR1：（23.97±0.34）%vs（26.59±0.78）% ，MRP： （17.03±0.59）% vs（19.43±0.60）%，P<0.01；LRP（24.02±0.63）%vs （26.43±1.06）%，GST：（23.93±0.59）% vs （26.24±1.06）%，P<0.05.Conclusion The high level expression of MRP， LRP， GST， and MDR1 may be the molecular basis of the multiple drug resistance of human HCC subpopulations， and drug resistance is one of the characteristics of hepatic stem cell.

Key words Hepatocellular carcinomas Heterogeneous subpopulations cells Multiple drug resistance

腫瘤細胞對細胞毒藥物的耐藥是影響腫瘤病人化療療效的一個重要因素， 人類多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）基因及其基因產物在腫瘤的多藥耐藥性中起著重要作用［１～3］。我們通過原代肝細胞癌細胞培養，克隆分離出了兩種不同形態、不同生物學特性及不同成瘤能力的肝細胞癌亞群細胞。本研究通過檢測化療藥物對這兩種亞群細胞生長的抑制程度及多耐藥基因在兩種亞群細胞中的表達水平，來探討HCC 組織中MDR基因表達與腫瘤的生物學特性和患者預后之間的關系，為臨床預測化療療效、指導合理用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

LCSC-1和LCSC-2亞群細胞：取材于同1例原發性肝細胞癌手術標本組織，通過原代細胞培養，采用有限稀釋法克隆分離出經鑒定具有不同形態和生物學特征的兩種細胞亞群，并且兩種亞群細胞的致瘤性也不相同 ［4］。主要試劑：DMEM、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素為美國Gibco公司產品；胰蛋白酶為Sigma公司產品；MTT、小鼠抗MDR1抗體、小鼠抗MRP抗體、小鼠抗LRP抗體、小鼠抗GST抗體、FITC標記兔抗小鼠IgG抗體為北京中山公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方法

人肝細胞癌LCSC-1、LCSC-2亞群細胞置于溫度為37℃ 含5% CO2氣體的培養箱中，選用含10%胎牛血清的DMEM培養基，常規培養兩種亞群細胞。

1.2.2 MTT法檢測化療藥物對人肝癌細胞亞群生長的抑制效應

1.2.2.1 實驗分組：用不含血清的DMEM培養基倍比稀釋化療藥物阿霉素（ADM）、順鉑（DDP）、足葉乙甙(VP-16)3種藥物，參照各藥臨床用量的血峰濃度，以每種單藥的不同濃度分組，分別加入，終濃度為：ADM 0.01、0.05、0.1、1.0、5.0 μg/ml，DDP 0.01、0.1、1、10、100 μg/ml，VP-16 0.1、1.0、10、100、200 μg/ml，上述藥物每種濃度設3個復孔。同時設3個復孔不加藥作為陰性對照。

1.2.2.2 MTT法檢測化療藥物對細胞生長的抑制作用 ：人肝細胞癌LCSC-1、LCSC-1亞群細胞，以每孔100 μl細胞懸液（含有1×105細胞）接種于96孔培養板，貼壁24 h后更換培養液。按實驗分組分別處理細胞。加藥組:腫瘤細胞懸液100 μL/孔，抗癌藥10 μL/孔，培養液90 μl /孔。陰性對照組不加抗癌藥，腫瘤細胞懸液100 μL/孔，培養液100 μL/孔；空白對照組只加培養液（200μL/孔）。24 h后更換為不含抗生素的培養液，加入MTT（5mg/ml）20 μl，繼續培養4 h。翻板法棄上清液，每孔加入0.2 ml二甲亞砜(DMSO)，將培養板在微量振蕩器上振蕩5 min，酶標儀上以570 nm 波長測各孔的吸光光度值(A)。按公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=( 1－實驗組A值/空白對照組值)×100%。利用IC50計算軟件分析藥物作用LCSC-1、LCSC-2細胞后半數抑制濃度IC50。

1.2.3 流式細胞儀分析耐藥蛋白的表達

（1）細胞培養 ：分別取對數生長期的LCSC-1、LCSC-2亞群細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，調整濃度為1×107/ml。(2) 實驗取100 μl的細胞懸液分別加入5 ml的EP管中，每亞群細胞各種耐藥蛋白檢測設3個復管，每亞群細胞設立1同型對照；每管加入100 μl Reagent A(固定液)，輕輕振蕩使細胞處于單細胞狀態，室溫孵育30 min。(3) 加入3 ml的PBS（含0.1%NaN3和5%FBS）輕輕振蕩混勻。(4) 離心（800轉/min，5min），沉淀細胞，棄上清液，剩約50 μl液體。(5) 在檢測MDR1的EP管中加入10 μl抗MDR1抗體原液。(6)在檢測MRP、LRP、GST的EP管中加入100 μl的Reagent B（破膜劑）和分別抗MRP、抗LRP、抗GST抗體原液10 μl，輕輕振蕩、混勻。并用統一亞型抗體作陰性對照；37℃孵育60 min。(7) 用PBS液洗去未結合的一抗，加入熒光標記的抗小鼠或兔的二抗，37℃孵育30 min；PBS液洗去多余的二抗。(8) 加入3 ml的PBS輕輕振蕩混勻。離心3 min（800轉/分），去上清液。(9) 加鞘液(PBS)500 μl，細胞重懸后上機檢測。或加入0.3～0.4 ml的1%多聚甲醛-0.01MPBS（ph7.4），振蕩混勻后24 h內上機檢測。(10) 流式細胞儀檢測（激發光395 nm，發射光570 nm）：同型對照管調零后，每管測5000個細胞。

1.3 統計學處理方法

所有結果均以x±S表示，采用SPSS10.0軟件進行t檢驗和析因方差分析進行組間比較，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 LCSC-1、LCSC-2亞群細胞的藥物敏感性

根據測得的每種藥物不同的細胞抑制率，利用IC50計算軟件分析藥物作用LCSC-1、LCSC-2細胞后半數抑制濃度IC50。兩種細胞亞群對阿霉素（ADM）、順鉑（DDP）、足葉乙甙(VP-16)等藥物都具有一定的耐藥性， 統計學分析顯示，3種藥物對LCSC-2亞群細胞和LCSC-1亞群細胞產生抑制的抑制率差異明顯不同 (P<0 .01) （見表1）。但LCSC-2亞群細胞對應這些化療藥的IC50值明顯高于LCSC-1亞群細胞。提示LCSC-2亞群細胞較LCSC-1亞群細胞有較高耐藥性。表1LCSC-1 細胞和LCSC-2 細胞對化療藥物的敏感性表1顯示，不同藥物影響下細胞IC50差異有顯著意義，F＝1254.389，P<0.001。不同藥物影響作用兩兩比較，LSD法，ADM與VP16、DDP與VP16兩組藥物差異均顯著，P<0.001。ADM與DDP兩組藥物差異不顯著，P＝0.07。不同細胞藥物作用下IC50差異也有顯著意義，F＝249.651，P<0.001。藥物與細胞兩個因素間存在交互效應，F＝163.181，P<0.001。

2.2 MRP、LRP、GST、MDR1在LCSC-1和LCSC-2亞群細胞上的表達差異

經流式細胞儀檢測，4種耐藥蛋白MDR1、MRP、LRP、GST在LCSC-1和LCSC-2兩種亞群細胞上的表達有顯著性差別（P<0 .05）。其中在LCSC-2亞群細胞上MDR1、MRP的表達較LCSC-1亞群細胞明顯增高（P<0 .01）。詳細結果見表2。

3 討論

肝細胞癌對化療藥物產生耐藥性是一種常見的臨床現象，也是影響肝細胞癌綜合療效的原因之一。近年來，腫瘤多重耐藥逐漸受到重視，腫瘤細胞對細胞毒藥物的抵抗被認為是腫瘤化療藥物耐藥的主要機制。研究證實：人類多藥耐藥基因及其基因產物在腫瘤的多藥耐藥性中起著重要作用，是腫瘤化療療效差的主要原因之一［5～8］。體外實驗表明，抑制多藥耐藥基因的表達可以增加耐藥細胞對化療藥物的敏感性［9，10］ 。有些腫瘤一開始即對化療藥物產生耐藥，即內源性耐藥；有些則是應用化療藥后產生耐藥，即獲得性耐藥，兩者有著相同的生物學基礎。對那些無多藥耐藥基因表達的組織或器官發生的腫瘤，許多文獻認為在化療后和復發時，腫瘤才出現耐藥基因的表達［11，12］。表2LCSC-1和LCSC-2細胞耐藥相關蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的熒光染色率情況

各種干細胞包括造血干細胞，特有表達耐藥蛋白如MDR1和ABC轉運蛋白［13，14］，可以將細胞毒性藥物排出至細胞以外，起到自我保護作用，免除毒性物質對細胞的損害，因而對化療藥物誘導凋亡不敏感［15，16］。如果腫瘤干細胞同樣可能比其他腫瘤細胞高水平表達這些蛋白，那么腫瘤干細胞也許更具耐藥性，這就可以解釋化學治療轉移腫瘤失敗的原因。目前，化療只是殺滅了已分化的具有有限增殖潛能的腫瘤細胞，使得腫瘤縮小，但是如果腫瘤干細胞存活，它們將持續腫瘤生長的過程。殺滅腫瘤干細胞也許能更有效地治療轉移癌。

我們研究發現，肝細胞癌細胞自身存在耐藥蛋白的表達，但不同的亞群耐藥蛋白的表達水平不同，對化療藥物耐藥程度也不相同，但都具有多藥耐藥性。LCSC-1細胞體外增殖快，倍增時間短，對化療藥物相對敏感；LCSC-2細胞亞群相對LCSC-1細胞亞群體外增殖慢，倍增時間長，對化療藥物相對不敏感。兩亞群細胞對化療藥物敏感性程度存在明顯的差別(P﹤0.05)。LCSC-1細胞耐藥蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的表達量較LCSC-2細胞低(P﹤0.05)，有統計學意義。腫瘤細胞耐藥蛋白的表達水平與其對化療藥物的敏感性呈負相關性。我們同時發現，肝細胞癌組織中的細胞具有異質性，而具有克隆擴增能力的亞群細胞相對具有耐藥性，這類細胞具有肝干細胞的相似表面標志。我們在前面實驗中證實LCSC-2 亞群具有干細胞的特性［４］，本實驗中又觀察到其高表達耐藥蛋白，證明耐藥是干細胞的特征之一。肝細胞癌異質性亞群細胞耐藥蛋白的異質性表達，可能介導了腫瘤細胞耐藥異質性這一腫瘤的重要特性。

LCSC-1和LCSC-2亞群細胞來源于同一個人。這種同一種病理類型同一個人來源的肝癌細胞未經化療藥物刺激誘導就存在耐藥有關蛋白表達的差異，讓我們聯想到：這種差異在干細胞分化時就產生了，干細胞在不對稱分裂時，不對稱分裂產生細胞質、細胞器不均分布，分裂后形成兩個不對稱細胞，因此產生了生物學特性不同，耐藥蛋白表達不同的異質性亞群細胞。這種理論也許解釋了腫瘤患者在進行了化療后腫瘤縮小或消失后但很快又復發的原因。因此，針對耐藥腫瘤干細胞的靶向化療可能是今后腫瘤治療的方向。

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