【摘要】 目的： 研究三七總皂苷（PNS）對骨髓瘤細胞RPMI8226黏附及黏附誘導耐藥的影響. 方法： 采用MTT法檢測PNS和/或阿霉素（Adr）對RPMI8226細胞的毒性作用；熒光染料二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記并流式細胞術檢測RPMI8226細胞與纖連蛋白（FN）黏附率. 結果： RPMI8226細胞與FN黏附2，12 h，其黏附率分別為(55.63±1.56)%，(65.42±2.46)%；經亞細胞毒濃度PNS（50 mg/L）預處理后，其黏附率分別降為(33.24±1.29)%，(34.16±1.59)%，處理前后差異有統計學意義（P<0.05）；FN黏附12 h后，瘤細胞對Adr的IC50值為（2.70±0.24） μmol/L，高于BSA對照組（2.03±0.13） μmol/L（P<0.05），經PNS處理后FN組Adr IC50值降至(1.08±0.09) μmol/L，與BSA對照組(0.82±0.07) μmol/L相比無統計學差異(P>0.05). 結論： PNS可降低RPMI8226細胞與FN的黏附率，并能部分逆轉黏附介導的骨髓瘤耐藥.

【關鍵詞】 三七總皂苷 多發性骨髓瘤 RPMI8226 黏附 抗藥性

0引言

多發性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）是一種難以治愈的漿細胞惡性腫瘤，難治性的生物學基礎是瘤細胞與細胞外基質（ECM）相互黏附介導的多藥耐藥形成（cell adhesion mediated drug resistance，CAMDR）. MM細胞與ECM間相互黏附主要通過細胞表面的整合素（integrin）與其配體纖連蛋白（fibronectin， FN）結合. 體外實驗證實，采用封閉性抗體阻斷整合素與FN間的相互作用，瘤細胞與FN間的黏附性明顯下降，其CAMDR也得以完全或部分逆轉［1］. 所以尋找高效低毒藥物以下調MM細胞的黏附性，從而增加瘤細胞對化療的敏感性具有重要意義. 中藥三七總皂苷（panax notoginoside，PNS）能抑制血小板的黏附與聚集，進而發揮其活血化瘀功效［2］. 鑒于血小板的黏附、聚集與MM細胞的黏附有著類似的生物學過程，因此，PNS能否下調骨髓瘤細胞黏附性從而逆轉黏附介導的腫瘤耐藥值得進一步研究. 為此，我們以人MM細胞株RPMI8226細胞為材料，初步探討PNS對MM細胞黏附性及CAMDR的影響.

1材料和方法

1.1材料血塞通注射液源自昆明制藥集團股份有限公司（每支含生藥250 mg，主要成份為人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，三七皂苷R1），-20℃分裝凍存；注射用鹽酸阿霉素（adriamycin，Adr）源自山西普德藥業有限公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司. 四氮唑藍（MTT），羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯［5(6)carboxyfluorescein diacetate Nsuccinimidyl ester，CFSE］為Sigma產品；纖連蛋白（FN）為Becton Dickinson產品，注射用水溶解分裝，-20℃凍存.

1.2方法

1.2.1細胞培養人多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞來源于蘇州大學免疫學教研室. 細胞培養于含100 mL/L熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養液中，置于50 mL/L CO2，飽和濕度、37℃培養箱中懸浮培養，實驗用細胞處于對數生長期.

1.2.2MTT實驗取對數生長期RPMI8226細胞按2.0×104/孔種入96孔板，根據預實驗設PNS濃度為50，75，100，200，300，400，600，800 mg/L，在相同實驗條件下，處理組中細胞分別加入不同濃度的PNS，每個濃度設3個平行孔，于加藥后24 h檢測，檢測前每孔加入MTT溶液（5 g/L） 10 μL，37℃孵育4 h后，加入100 μL 100 g/L SDS（含0.01 mol/L HCl），充分溶解結晶物［3］，570 nm波長測定各孔A值，實驗重復3次，取平均值，計算生長抑制率［（1-試驗組A值/對照組A值)×100％］.

1.2.3黏附實驗用無菌過濾的TSM(20 mmol/L TrisHCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH8.0)配制50 mg/L的FN及10 g/L BSA［4］，每孔50 μL分別包被96孔板，4℃過夜. 取對數生長期RPMI8226細胞（1.0×109/L），37℃，50 mL/L CO2條件下以2.5 mg/L CFSE標記30 min，加無血清RPMI1640液孵育12 h. CFSE標記細胞經非抑制濃度PNS（50 mg/L）預孵育2 h后，按細胞/2.0×104孔，種入96孔板. 實驗分4組：① FN包被組；② BSA包被組；③ PNS+FN組；④ PNS+BSA組. 各組細胞分別37℃，50 mL/L CO2中培養2 h與12 h. 收集上清（含未黏附細胞），經流式細胞儀檢測CFSE陽性細胞數. 細胞黏附率(%) =（1-上清液細胞數/總細胞數）×100%［5］.

1.2.4PNS對RPMI8226細胞CAMDR的影響FN與BSA包被處理同前. 對數生長期RPMI8226細胞經非抑制濃度PNS（50 mg/L）預孵育2 h后，按細胞2.0×104/孔，種入96孔板，黏附12 h，每孔分別加入不同濃度Adr（0.25，0.5，0.75 μmol/L），作用1 h，離心棄上清，加完全RPMI1640液培養24 h. 按MTT法測定生長抑制率(％)［6］. 實驗分4組:① FN+Adr組；② BSA+Adr組；③ PNS+Adr+FN組；④ PNS+Adr+BSA組.

統計學處理:用SPSS11.0軟件進行處理，實驗結果以x±s表示，組間均數比較用方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗.

2結果

2.1PNS對RPMI8226細胞增殖的影響PNS對RPMI8226細胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性，其24 h IC50值為(216.52±2.31) mg/L（圖1）.

圖1不同濃度PNS對RPMI8226細胞增殖的影響

2.2PNS對RPMI8226細胞黏附的抑制作用RPMI8226細胞黏附2 h，FN組黏附率(55.63±1.56)%高于PNS+FN組(33.24±1.29)%（P<0.05），PNS+FN組黏附率高于BSA組（9.56±0.85）%及PNS+BSA（9.01±0.76）%（P<0.05）；包被12 h，FN組黏附率略增加至(65.42±2.46)%，與其2 h黏附率相比無統計學差異（P>0.05），其余實驗組12 h黏附率無統計學變化.

2.3PNS逆轉RPMI8226細胞CAMDR經Adr作用24 h后，BSA對照組呈濃度依賴性凋亡，其IC50為（2.03±0.13） μmol/L；MM細胞與FN黏附后可以挽救Adr誘導的細胞凋亡，其IC50 （2.70±0.24） μmol/L，高于BSA對照組(P<0.05)；經50 mg/L PNS處理后，FN組RPMI8226細胞對Adr的敏感性提高，其IC50值降至(1.08±0.09) μmol/L，與BSA對照組IC50（0.82±0.07） μmol/L相比，無統計學差異（P>0.05），說明PNS能部分逆黏附介導的MM細胞耐藥性.

3討論

CAMDR是多發性骨髓瘤難以治愈的主要生物學機制之一［7］. 篩選高效抑制瘤細胞黏附并且能逆轉其CAMDR的藥物，已成為骨髓瘤治療領域的研究熱點. PNS可以抑制ADP，花生四稀酸、血小板活化因子、凝血酶、膠原等誘導的血小板聚集；也可抑制內毒素誘導的粒細胞黏附分子的表達，進而降低白細胞與細靜脈內皮之間的黏附性. PNS的抗細胞黏附、抗血小板聚集作用極可能為其化“瘀”功效的生物學機制之一. 鑒于MM細胞與胞外基質成分（如纖連蛋白等）之間的相互黏附也可部分理解為中醫學的“瘀”癥，故利用PNS的化“瘀”功效下調MM細胞的黏附性，以部分逆轉黏附介導的MM耐藥性就具有潛在的研究價值. 本實驗證實，非抑制濃度PNS可顯著抑制RPMI8226細胞對基質成分FN的黏附性，進而降低FN黏附組MM細胞對阿霉素的IC50值. 表明PNS能部分逆轉MM細胞的CAMDR，其效應機制可能與下調MM細胞與FN間的黏附性有關.