【摘要】 目的： 探討中西藥結(jié)合對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR的逆轉(zhuǎn)和誘導(dǎo)凋亡作用. 方法： 以斑貞1號(hào)和/或氟尿嘧啶（5FU）為陽(yáng)性對(duì)照組，采用MTT法觀察斑貞1號(hào)與5FU，川芎嗪（TMP）聯(lián)合對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)及殺傷作用. 采用流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定各藥物組細(xì)胞周期的變化. 光鏡和電鏡觀察藥物聯(lián)合前后SGC7901/ADR細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化. 結(jié)果： TMP明顯提高SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)斑貞1號(hào)+5FU的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為10.39倍. 細(xì)胞毒作用為:斑貞1號(hào)+5FU+TMP>斑貞1號(hào)+5FU>斑貞1號(hào)>5FU（P<0.01）. FCM分析證明3種藥物聯(lián)合與對(duì)照組相比可將細(xì)胞阻滯在DNA合成前期和靜息期G0/G1期（P<0.05）. 光鏡和電鏡下觀察到癌細(xì)胞體積變小，胞體全面變圓皺縮及典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變. 結(jié)論： 中西藥結(jié)合對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)和誘導(dǎo)凋亡作用，為當(dāng)前腫瘤治療提供了新思路.

【關(guān)鍵詞】 西醫(yī)結(jié)合">中西醫(yī)結(jié)合療法 胃腫瘤 腫瘤細(xì)胞 多藥耐藥性 逆轉(zhuǎn) 調(diào)亡

0引言

化療在胃癌綜合治療中發(fā)揮著重要作用，但療效差，主要是細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）［1-2］. 解決MDR主要方法，一是尋找對(duì)MDR細(xì)胞有效的抗腫瘤藥物，二是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度而逆轉(zhuǎn)MDR. 但多數(shù)逆轉(zhuǎn)劑的毒副作用限制了它們的臨床應(yīng)用. 中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤較中醫(yī)或西醫(yī)單獨(dú)應(yīng)用療效佳，但對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞是否有逆轉(zhuǎn)作用，報(bào)道甚少. 我們觀察中西藥結(jié)合（斑貞1號(hào)+5FU+TMP）對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)及誘導(dǎo)凋亡作用.

1材料和方法

1.1材料人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化研究所惠贈(zèng). TMP注射液，北京永康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品. 5FU注射液，南通精華制藥有限公司產(chǎn)品. 阿霉素（ADM）注射液，汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品. 斑貞1號(hào)合劑（斑蝥0.06 g，露蜂房12 g，山茱萸，女貞子各15 g），內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科制備，含原藥200 g/L. RPMI1640，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品. MTT，DMSO，胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品. 新生小牛血清，杭州四季青生物研究所產(chǎn)品. 流式細(xì)胞儀試劑盒，Exalpa公司產(chǎn)品. 倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品. 酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司產(chǎn)品. 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品. Hitachi750透射電鏡，日本日立公司產(chǎn)品.

1.2方法將SGC7901/ADR細(xì)胞置于含1.0 mg/L ADM，100 mL/L新生小牛血清，100 kU/L青霉素，100 mg/L 鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃，50 mL/L CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng). 實(shí)驗(yàn)兩周前培養(yǎng)于不含ADM的細(xì)胞培養(yǎng)液中. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901/ADR細(xì)胞，以5×107/L接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)孔按下列分組加入藥物：(1)空白對(duì)照組，(2)陰性對(duì)照組，(3)5FU組（10～105μg/L），(4)斑貞1號(hào)組（10～105μg/L），(5)斑貞1號(hào)（10～105μg/L）＋5FU（10～105μg/L）組，(6)斑貞1號(hào)（10～105μg/L）＋5FU（10～105μg/L）＋TMP(終濃度300 mg/L)（參照臨床用量的血峰濃度設(shè)定實(shí)驗(yàn)藥物濃度）. 各濃度設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 20 μL，作用4 h后加入DMSO150 μL，搖床搖勻，以酶聯(lián)免疫儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度A值［3］. 光鏡下動(dòng)態(tài)觀察并拍照. 計(jì)算不同濃度下細(xì)胞的存活率SR［4］［SR=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%］、半數(shù)抑制濃度IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RI(RI=單獨(dú)用藥IC50/聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑后IC50).

1.2.1細(xì)胞周期的分析收集經(jīng)過(guò)不同濃度藥物處理的SGC7901/ADR細(xì)胞，PBS洗滌后，700 mL/L冷乙醇固定過(guò)夜，離心去乙醇，加入10 mg/L RNA酶溶液及碘化丙啶（PI）染液，黑暗避光37℃水浴20 min，經(jīng)特制的尼綸網(wǎng)濾器過(guò)濾（冰上操作）于檢測(cè)管內(nèi)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量和細(xì)胞周期，資料用Cellquest軟件進(jìn)行分析.

1.2.2細(xì)胞形態(tài)變化將SGC7901/ADR細(xì)胞以5×107/L傳代4瓶，2瓶對(duì)照，2瓶用藥. 孵育24 h后，用藥組加入斑貞1號(hào)（終濃度0.5 mg/L）+5FU（終濃度0.5 mg/L）+TMP（終濃度300 mg/L）共4 mL，對(duì)照組更換培養(yǎng)液4 mL. 培養(yǎng)48 h后收集胰酶消化脫壁細(xì)胞，25 g/L戊二醛預(yù)固定，繼用20 g/L俄酸固定，經(jīng)梯度酒精脫水后用EPON812包埋，制作超薄切片（600 A），染色按常規(guī)處理，經(jīng)醋酸鈉和檸檬酸鋁雙染后，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)并拍照.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 計(jì)量數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析及LSDt檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1SGC7901/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)和細(xì)胞毒作用300 mg/L TMP與斑貞1號(hào)和5FU聯(lián)合可增強(qiáng)SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)斑貞1號(hào)+5FU的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為10.39倍，使其殺瘤效果增強(qiáng). 對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用依次為:斑貞1號(hào)+5FU+TMP>斑貞1號(hào)+5FU>斑貞1號(hào)>5FU（P<0.01，表1）. 光鏡下可見(jiàn)中西醫(yī)結(jié)合組癌細(xì)胞體積變小，胞體全面變圓皺縮，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制（圖1）.

表1中西藥聯(lián)合對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（略） bP<0.01 vs 5FU組和斑貞1號(hào)+5FU組.

A: 陰性對(duì)照組; B: 斑貞1號(hào)+5Fu+TMP組.

圖1SGC7901/ADR細(xì)胞形態(tài)倒置顯微鏡 ×400（略）

2.2細(xì)胞周期分析中西藥結(jié)合組可使SGC7901/ADR細(xì)胞周期明顯阻滯在DNA合成前期和靜息期G0/G1期，進(jìn)入S期細(xì)胞減少，抑制細(xì)胞DNA的合成和有絲分裂（P<0.05），誘導(dǎo)其凋亡（表2）.

2.3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化對(duì)照組癌細(xì)胞呈圓形或卵圓形，核大而不規(guī)則，核質(zhì)比例大，核內(nèi)異染色質(zhì)較細(xì)，均勻分于核膜內(nèi)側(cè)，核仁1~2個(gè)，清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)較少(圖2A). 用藥組癌細(xì)胞發(fā)生皺縮，胞膜表面微絨毛和偽足消失. 核縮小，核質(zhì)比例小，部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型凋亡改變，核固縮成球形或新月形或呈波紋狀或折縫樣，核仁消失，胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹，出現(xiàn)空炮變性，繼之細(xì)胞出泡，小泡脫落，大量凋亡小體形成(圖2B).

表2藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響（略）

A: 對(duì)照組×4000； B: 用藥組×5000.

圖2SGC7901/ADR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（略）

3討論

MDR是指腫瘤細(xì)胞接觸一種化療藥物并產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物具交叉耐藥性［5］. 5FU是主要治療胃癌化療藥物之一，本課題組先前已證實(shí)了SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)5FU具有耐藥性，相對(duì)耐藥性為97.49. 同時(shí)在尋找高效低毒的逆轉(zhuǎn)劑研究中，也證實(shí)了TMP較維拉帕米（VP）有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用. 然而腫瘤細(xì)胞的MDR是由多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，涉及到多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變、解毒系統(tǒng)的激活、凋亡通路的改變、DNA修復(fù)系統(tǒng)的增強(qiáng)等，特別是多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同轉(zhuǎn)運(yùn)一種抗癌藥形成的耐藥性是導(dǎo)致目前的逆轉(zhuǎn)只能部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的重要原因. 許多研究表明［6］，中西藥有機(jī)結(jié)合使用，可互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用. 因此，有計(jì)劃、合理地運(yùn)用中西醫(yī)結(jié)合治療便成為逆轉(zhuǎn)MDR，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，提高療效的重要措施.

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為胃癌病機(jī)要點(diǎn)為臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，痰濁瘀毒，積聚凝結(jié)，胃腑壅塞，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，治療多采用殺毒化瘤、補(bǔ)氣養(yǎng)血之法. 斑貞1號(hào)具有扶正祛邪，抑癌抗癌的作用. 本課題結(jié)果表明，TMP可以明顯提高SGC7901/ADR細(xì)胞對(duì)斑貞1號(hào)和5FU的敏感性，三種藥物聯(lián)合與對(duì)照組相比對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，使胃癌耐藥細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期. 其機(jī)制是否通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)骨架微管和微絲結(jié)構(gòu)，引起骨架異常，導(dǎo)致有絲分裂紊亂？或是影響多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)及功能?調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)凋亡？這些問(wèn)題值得進(jìn)一步深入研究. 通過(guò)對(duì)斑貞1號(hào)聯(lián)合5FU及TMP對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性的作用和機(jī)制的研究，將會(huì)為胃癌多藥耐藥的治療提供可靠的依據(jù).

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