作者：劉林，張敏，鄒萍，田蕾，劉芳

【摘要】 為了探討小干擾RNA（siRNA）對K562/A02細胞Polo樣激酶1（PLK1）基因的抑制作用及其對細胞周期、細胞增殖和耐藥性的影響，將構建的針對PLK1 mRNA的siRNA真核質粒，導入K562/A02細胞，用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在轉染前后的表達差異；臺盼藍拒染試驗檢測細胞存活率；流式細胞術（FACS）檢測細胞周期和細胞內阿霉素（ADM）的積累量；MTT試驗檢測細胞對ADM的藥物敏感性。結果顯示，與對照組相比，轉染24和48小時后，siRNA-PLK1質粒轉染組的PLK1 mRNA下降（34.7±2.1）%和（56.6±1.5）%，蛋白水平下降（49.9±3.2）%和（62.1±1.7）%；轉染24和48小時后，細胞存活率下降了30%和59%；轉染48小時后，G2/M期細胞比例提高了2.77倍，同時細胞內ADM積累量顯著提高；對ADM藥物敏感性的相對率為73.8%。結論： PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02細胞生長，使細胞周期停滯在G2/M期，同時使得細胞內ADM積累量提高，對ADM敏感性增強。

【關鍵詞】 PLK1基因沉默

Effect of PLK1 Gene Silence on Cell Cycle，Proliferation and Drug Resistance in K562/A02 Cells

Abstract The study was purposed to investigate the effect of small interference RNA (siRNA) targeting Polo-like kinase 1 (PLK1) gene on cell cycle progression，proliferation and drug resistance in K562/A02 cells.siRNA plasmid vector specifically targeting PLK1 gene with enhanced green fluorescence protein (EGFP) was transfected into K562/A02 cells.Expressions of PLK1 mRNA and protein were assayed by RT-PCR and Western-blot; cell proliferation was evaluated by direct cell counting after trypan blue staining.Cell cycle and intracellular adriamycin（ADM）accumulation was determined by flow cytometry; 50% inhibition concentration (IC50) of ADM on K562/A02 cells was determined by MTT method.The results showed that，as compared with control cells，siRNA plasmid reduced PLK1 mRNA expression by（34.7±2.1）% for 24 hours and by（56.6±1.5）% for 48 hours，PLK1 protein significantly decreased simultaneously by (49.9±3.2)% and by (62.1±1.7)%.After being transfected for 24 and 48 hours，the rate of survival cells decreased by 30% and 59% respectively.Forty-eight hours after transfection，the ratio of K562/A02 cells at G2/M increased by 2.77-fold，at the same time，intracellular ADM accumulation increased and the relative efficiency of K562/A02 cells to ADM was 73.8%.It is concluded that PLK1 gene silence can inhibit K562/A02 cell proliferation，induce cell cycle arrest at G2/M，and increase intracellular ADM accumulation，so that enhance cell sensitivity to ADM.

Key words PLK1 gene silence; siRNA plasmid; K562 cell/A02 cell; cell cycle; drug resistance

Polo樣激酶1（Polo-like kinase 1，PLK1）為polo樣激酶家族的成員之一，其基因由于和果蠅Polo基因序列具有高度同源性，且基因編碼產物表現為絲氨酸/蘇氨酸激酶特性而得名。PLK1主要參與細胞有絲分裂調控：促進cyclin B/Cdc2的激活，協助中心體的功能成熟和雙極性紡錘體的形成，調節促后期復合體（anaphase-promoting complex，APC）參與有絲分裂晚期事件，以及影響胞質分裂等［1］。研究發現，PLK1在多種腫瘤細胞中異常高表達，抑制其功能或表達會導致細胞周期停滯并誘導細胞凋亡，推測PLK1可能與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關［2］。本研究采用小RNA干擾技術抑制K562/A02耐藥細胞中PLK1的表達，分析其對細胞周期和增殖的影響，并初步探討其在逆轉細胞耐藥方面的可能作用。

材料和方法

材料

細胞系

人紅白血病細胞系K562為華中科技大學同濟醫學院免疫室惠贈，經阿霉素誘導產生的耐藥細胞系K562/A02購自中國醫學科學院血液病研究所。 主要試劑 TRIZOL試劑、Lipofactamine 2000和Opti-MEMⅠ購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒、Taq酶和dNTP購自MBI公司；兔抗人PLK1多克隆抗體購自Biolegend公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購自Pierce公司；MTT購自Amresco公司；ADM購自深圳萬樂藥業有限公司；碘化丙錠（PI）和臺盼藍購自Sigma公司；RPMI 1640和新生牛血清購自Gibco BRL公司；shRNA寡核苷酸序列和PCR引物序列由上海博亞生物有限公司合成。

方法

細胞培養

K562，K562/A02細胞使用RPMI 1640培養液（含有10%新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素），在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。此外，K562/A02需維持培養在含1 μg/ml ADM的培養液中，實驗前無藥培養2周。

質粒構建

攜帶增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的siRNA真核表達載體和針對PLK1 mRNA位點1416-1436（NCBI GenBank 序列號：X75932）的siRNA已由本室成功構建并經測序證實，分別命名為pEGFP-H1（空載體）和pEGFP-PLK1。針對PLK1靶基因的siRNA寡核苷酸具體序列如下：正義鏈：5’TCCCGCAGTACATAGAGCGTGACGGTCAAGAGCCGTC-ACGCTCTATGTACTGCTT 3’，反義鏈：5’CAAAAAGCAGTACATAGAGCGTGACGGCTCTTGACCGTCACG-CTCTATGTACTGC 3’。

細胞轉染

將處于對數生長期的K562/A02細胞分為3組：空白對照組、pEGFP-H1空載體轉染組和pEGFP-PLK1轉染組，按Lipofactamine 2000轉染說明書轉染K562/A02細胞。轉染后24和48小時收獲細胞進行實驗。每組實驗重復3次。

PLK1 mRNA表達的RT-PCR檢測

轉染后的24和48小時，收集上述3組細胞，以TRIZOL試劑提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后，取1 μl進行PCR反應，以β-actin作為內參照。PLK1的PCR引物序列為：上游引物5＇TTCGTGTTCGTGGTGTTGGA 3＇，下游引物5＇CTCGTCATTAAGCAGCTCGT 3＇，擴增產物為563 bp。PCR反應體系20 μl，反應條件：95℃預變性3分鐘，95℃ 40秒，58℃ 50秒，72℃ 1分鐘，30個循環，最后72℃延伸5分鐘。取5 μl PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外照相并掃描分析，以PLK1/β-actin條帶的光密度比值進行PLK1基因表達水平半定量分析。

PLK1蛋白表達的Western-blot檢測

轉染后的24和48小時，收集3組細胞，按

細胞成活率的臺盼藍拒染試驗檢測

轉染后24和48小時，收集3組細胞，用PBS洗2遍后重懸于0.5 ml PBS，用體積分數0.4%的臺盼藍等滲鹽溶液與細胞懸液以1∶9的比例混合，1分鐘內在相差顯微鏡下觀察，計算出未著色細胞數（即活細胞數）所占細胞總數的百分率，即為細胞的成活率。

細胞周期的FACS檢測

轉染后48小時，收集3組細胞，用體積分數70%乙醇-20℃固定過夜，PBS洗2遍后，重懸于0.5 ml PBS，加入 PI 和RNA酶至終濃度分別為10 μg/ml和100 μg/ml，4℃孵育30分鐘，上機檢測。

細胞內阿霉素（ADM）積累量的FACS檢測

轉染后48小時，K562細胞和上述3組細胞調節成1×106/ml的濃度，分別與1 μg/ml的ADM在37℃共同孵育1小時，用預冷的PBS洗2遍后，冰浴以中止ADM的作用，參照文獻[4］，經流式細胞儀檢測細胞內的ADM穩態積累量。

ADM的半數抑制濃度（IC50）的MTT法檢測

轉染后48小時，將K562細胞和上述3組細胞調整為1×104/ml，在96孔板的各孔中加入180 μl的細胞和不同濃度的ADM 20 μl（終濃度為0.01-100 μg /ml）；每個濃度設3個平行孔，培養48-72小時；每孔加入MTT（5 mg/ml） 20 μl，繼續培養4小時后，加入DMSO 150 μl終止反應，選擇570 nm波長測定各孔吸光度值（A值）。細胞的生長抑制率（%）=（1－試驗孔A/對照孔A）×100%，根據生長抑制率計算半數抑制濃度（IC50）。相對逆轉效率=（IC50A-IC50B）/（IC50A-IC50C）×100%，其中IC50A是K562/A02細胞的IC50，IC50B是轉染載體后的K562/A02細胞的IC50，IC50C是K562細胞的IC50。

統計學處理

數據以均值±標準差（ ±SD）表示，采用配對資料t檢驗、方差分析和q檢驗，用SPSS 11.5統計學軟件處理。

結果

倒置熒光顯微鏡下觀察K562/A02細胞的轉染結果 轉染后24和48小時，鏡下可見大量細胞表達綠色熒光蛋白（圖1）。

SiRNA抑制K562/A02細胞PLK1基因和蛋白的表達

RT-PCR擴增PLK1和β-actin的片段分別位于563 bp和250 bp處。K562/A02細胞轉染pEGFP-PLK1 24小時后，PLK1 mRNA的下降（34.7±2.1）%，48小時后下降了（56.6±1.5）%（P<0.05）?？蛰d體轉染組PLK1 mRNA表達水平與空白對照組無顯著差異（圖2）。

Western-blot結果與此相似。轉染pEGFP-PLK1 24小時后，K562/A02細胞PLK1蛋白表達下降（49.9±3.2）%，48小時后下降到了（62.1±1.7）%(P<0.05)。空載體轉染組PLK1蛋白表達水平與空白對照組無顯著差異（圖3）。

SiRNA對細胞存活率的影響

臺盼藍染色記數結果見圖4。轉染后的24和48小時，轉染pEGFP-PLK1細胞存活率分別下降了30%和59%，推斷siRNA能有效抑制細胞增生。

SiRNA對細胞周期的影響

轉染pEGFP-PLK1 48小時后，FACS檢測結果見圖5。 K562/A02細胞G0/G1期的比例由60.22%下降為40.85%，G2/M期細胞比例由10.18%上升至28.17%（P<0.05），且凋亡細胞比例明顯增多。空載體轉染組變化不明顯（表1）。

SiRNA對K562/A02細胞內ADM積累的影響

轉染pEGFP-PLK1 48小時后，FACS檢測細胞內ADM結果見圖6。轉染pEGFP-PLK1質粒組細胞內ADM的平均熒光強度由10.88提高至98.36(P＜0.05)，陽性細胞率也由1.66%增加到56.32%（P＜0.05），空載體轉染組變化不明顯（表2）。Table 2. Effect of siRNA on ADM intracellular accumulation of K562/A02 cells（略）

SiRNA對K562/A02細胞對ADM敏感性的影響

轉染pEGFP-PL K1質粒48小時后的K562/A02細胞對化療藥物ADM的敏感性明顯增加，相對逆轉效率為73.8%（表3），而空載體轉染組無明顯變化，推斷轉染pEGFP-PLK1質粒可以恢復K562/A02細胞對ADM的敏感性。Table 3. Effect of siRNA on IC50 of ADM of K562/A02 cells（略）

討論

PLK1是新近發現的一種細胞周期調控分子，在G2/M期表達且活性最高，主要位于細胞的中心體和分裂期細胞的中體，其表達和活性在有絲分裂指數高的組織和細胞中明顯增高，如胚胎、結腸和腫瘤組織［5］?，F已發現，PLK1在多種腫瘤細胞中異常高表達，其表達情況可作為預后判斷的參考因素之一［6］。有關非小細胞肺癌的研究表明，PLK1的表達與放、化療的療效相關，表達水平高者療效低下且易于耐藥［7］，這表明PLK1可能參與腫瘤細胞的耐藥機制。

本研究將構建的特異性針對PLK1 mRNA的siRNA載體導入K562/A02細胞，結果顯示，其在轉染后的24和48小時能有效且特異性抑制PLK1的表達，減緩K562/A02細胞的增殖，使細胞周期停滯在G2/M期并誘導細胞凋亡。結果與Liu等［3］的實驗的結果類似。與此同時，本研究還發現，在轉染后的48小時，抑制PLK1的表達尚能提高K562/A02細胞內ADM的積累量，并能明顯恢復細胞對ADM的敏感性。分析其原因可能是，一方面針對PLK1的siRNA間接抑制K562/A02細胞的膜泵功能。Chamberst 等［8］證明，PKC可磷酸化P-gp，而PKC是PLK1的磷酸化底物之一［9］。抑制PLK1的表達可能使得PKC活化受抑，從而影響P-gp的功能，使得細胞內ADM積累量增加，ADM殺傷細胞能力增強。另一方面，抑制PLK1使得K562/A02細胞G0/G1期細胞減少，G2/M期細胞增多，更多細胞進入增殖周期，從而增強細胞對ADM的敏感性。

白血病細胞耐藥是多基因、多種耐藥機制共同作用的結果（如mdr1、LRP、GST和bcl-2等）［10］，使得針對某單一因素的方法常難以奏效。本研究雖是體外實驗24和48小時的結果，但仍然顯示PLK1基因沉默在逆轉細胞耐藥方面可能起著重要作用。若能在針對其他耐藥基因的基礎上，結合本研究的結果，即靶向性地封閉瘤細胞PLK1的表達，將能更有效地逆轉腫瘤細胞耐藥，為未來腫瘤的治療提供新的有效途徑。