作者：王海燕張敏鄒萍游泳郭靜明唐曉瓊趙智剛 吳耀輝

【摘要】 本研究探討活化的Chk1對白血病細胞周期及凋亡的影響，探究Chk1調控腫瘤細胞耐藥的機制。以慢性粒細胞白血病細胞系K562及其耐藥細胞系K562/A02（耐阿霉素）為研究對象，與阿霉素共孵育后，用流式細胞術檢測細胞周期分布，RT-PCR檢測Chk1mRNA表達水平，Western blot檢測轉染前后Chk1磷酸化水平；靶向Chk1shRNA抑制細胞內Chk1的表達后，用流式細胞術檢測阿霉素作用后細胞的凋亡情況。結果表明：阿霉素致K562/A02細胞阻滯在G2/M期的細胞百分率為（54.12±0.57）％，顯著高于K562細胞（36.99±1.28）%； Chk1mRNA表達水平在K562與K562/A02細胞間無顯著差異； Chk1磷酸化水平在K562/A02細胞為0.79 ± 0.56，在K562細胞為0.27 ± 1.47，其差異有統計學意義。轉染Chk1shRNA后，兩株細胞的Chk1磷酸化水平顯著下降。轉染組K562、K562/A02細胞凋亡率分別是空載體轉染組的1.30倍和3.84倍。結論： Chk1的活化水平調控著K562/A02細胞對阿霉素的敏感性。

【關鍵詞】 Chk1 G2/M期阻滯 K562細胞 K562/A02細胞RNA干擾 白血病細胞耐藥

Mechanism of G2/M Blockage Triggered by Activated-Chk1 in Regulation of Drug-resistance in K562/A02 Cell Line

Key wordsChk1; G2/M arrest; K562 cell; K562/A02 cell line; RNA interference; leukemia cell drug-resistance

細胞周期G2/M檢測點是監控細胞進入有絲分裂期的重要關卡。當放療及化療等因素致細胞DNA雙鏈斷裂（double strand breaks， DSB）后，三磷酸肌醇激酶的激酶(PIKK)家族成員ATR識別受損的DNA，將損傷信號通過其下游的因子如H2AX、 NBS1、BRCA1傳遞給細胞周期檢測點激酶，從而使細胞周期阻滯在G2/M期，修復受損的DNA，使其繼續進入細胞周期；如損傷廣泛，則誘導凋亡。已有研究表明，化療藥物順鉑、絲裂霉素C引起的G2/M期阻滯延長與腫瘤細胞抗凋亡能力增強有關［1］；而且，原發耐藥的腫瘤細胞本身具有阻滯在G2/M期的能力，且在此期延長［2］。這些結果表明，G2/M期檢測點在腫瘤細胞耐藥中發揮重要作用。細胞周期檢測點激酶1（checkpoint kinase1， Chk1）是調控G2/M期檢測點主要效應分子之一。我們前期的研究表明，應用RNA干擾技術抑制Chk1在K562/A02細胞中的表達，解除了G2/M期阻滯，增強了阿霉素誘導的細胞凋亡，這說明了Chk1參與了K562/A02細胞的耐藥。但Chk1是如何影響腫瘤細胞的耐藥特性尚不清楚，對此本研究作了進一步探討。 材料和方法

材料和試劑

K562細胞系敏感株K562、多藥耐藥株K562/A02為本室保存株。攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的RNAi真核表達載體pEGFP-H1和針對Chk1基因的短發夾狀RNA（shRNA）pEGFP-H1/Chk1shRNA均由本室構建并經測序證實。RPMI 1640培養液、胎牛血清購自Gibco公司。逆轉錄試劑盒購自MBI公司，Taq DNA聚合酶購自北京天為時代生物公司。質粒小量柱式抽提試劑盒購自上海華順生物公司。人β-actin和Chk1引物由上海生物工程公司合成。G418、碘化丙錠（PI）購自Sigma公司。兔抗人Chk1磷酸化抗體(S345)購自Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為北京中山生物工程公司產品。AnnexinV-cy5凋亡試劑盒購自Becton Dickinson公司。

方法

細胞培養K562、K562/A02于含10％胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI 1640培養液中，在37℃、5％ CO2、水飽和濕度條件下培養。以常規方法誘導K562/A02細胞的耐藥性［ 3］，并于實驗前兩周置于普通培養液進行培養。

細胞周期分析分別收集阿霉素(1 μg/ml)作用后6小時、24小時的K562、K562/A02兩組細胞各1×106個，設未經藥物處理的空白對照組，以冰凍的PBS洗2次，70%的乙醇4℃固定過夜，離心去上清，PBS洗2次后，加入0.3 ml 20 μg/ml的PI（含0.2 mg/ml RNA酶）染色，室溫避光30分鐘，用流式細胞術檢測細胞周期的分布。

半定量RT-PCR分別收集阿霉素處理6小時后各組細胞2×106 個，TRIZOL試劑提取其總RNA，紫外分光光度計測定RNA的含量，以3 μg RNA為模板逆轉錄成cDNA后，進行PCR反應，以β-actin為內參照。β-actin 的PCR引物序列為：上游引物5'-TGTACGTTGCTATCCAGGCT-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'，產物長度241 bp。Chk1 的PCR引物序列為：上游引物5'-TGAAGCCGGCCGTAGACT-3'，下游引物5'-TCCACAGGACCAAACATC-3'。PCR的擴增條件：95℃預變性3分鐘， 95℃變性1分鐘， 55℃退火50秒， 72℃延伸1分鐘，這3步循環30次，72℃延伸5分鐘。產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳分析結果。 Chk1磷酸化水平Western blot檢測細胞分組處理同上，按照

細胞轉染 、鑒定K562和K562/A02細胞各分組如下： ①未轉染對照組、②PEGFP-H1空載體轉染組、③PEGFP-H1/Chk1轉染組。細胞密度調整為1×105/ml，在560 V，60 μs，電擊1次的條件下行電穿孔轉染（Eppendorf電轉儀，購自基因公司），轉染后的細胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養液中培養24-48小時后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效果。并在培養液中加入G418（終濃度400 μg/ml）篩選穩定株。實驗前，換用不含G418的培養液，細胞處理和方法同Western blot。

細胞凋亡檢測細胞分組同細胞轉染、鑒定，收集阿霉素誘導凋亡6小時后的各組細胞和未處理的空白對照組，PBS洗2次后，調整細胞濃度為2×105/ml，分別經AnnexinV-cy5標記后，流式細胞術檢測細胞凋亡。

統計學分析

以上實驗均重復3次。實驗數據應用SPSS 11.5軟件包進行分析，所有結果均以均數±標準差（±SD）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，配伍組間比較采用多因素方差分析， P<0.05為有統計學意義。Table. Effect of adrimycin(1 μg/ml) on cell cycle distribution of the K562 and K562/A02 cell lines（略）.

結果

細胞周期的分布

阿霉素作用6小時后，K562細胞分布在G2/M期的百分率為(36.99 ± 1.28)％，K562/A02為(54.11 ± 0.57)％，兩者差異有顯著性（P<0.05），提示在耐藥細胞株中G2/M期的阻滯明顯延長，且于6小時阻滯在G2/M期的細胞較高（附表） 。

Chk1mRNA水平在K562和K562/A02間的表達差異

由PCR電泳可見，β-actin與Chk1分別位于241 bp和461 bp處(圖1)，通過凝膠圖像分析儀掃描Chk1與β-actin條帶的光密度比值：K562細胞為0.82±0.76，K562/A02為0.86±1.41，可見Chk1mRNA水平的表達在兩株細胞內無顯著差異（P>0.05）。

Chk1磷酸化水平在K562和K562/A02間的表達差異

Weston-blot分析顯示，K562/A02細胞的Chk1磷酸化水平顯著高于K562細胞（圖2），掃描電泳條帶的灰度比值分別為0.79 ±0.56和0.27 ± 1.47，兩者差異有顯著性（P<0.05）， Chk1的活化水平與G2/M期細胞的百分比呈正相關。

Chk1shRNA對Chk1磷酸化水平的影響

轉染Chk1shRNA的細胞，由于shRNA靶向抑制了Chk1mRNA表達，使磷酸化水平下降。K562細胞轉染組的Chk1磷酸化水平較空載體組下降73%，而K562/A02細胞轉染組的Chk1磷酸化水平較空載體組下降85%，Chk1shRNA轉染組細胞與空載體組、未轉染組相比有顯著差異（P<0.05），但轉染組細胞K562與 K562/A02兩者間無顯著差異（圖3）。

細胞凋亡的檢測

應用Annexin V-cy5凋亡試劑盒檢測上述各組細胞的早期凋亡發現，阿霉素處理6小時后，K562、K562/A02細胞空載體組的凋亡率分別為42.13% ± 1.12%、5.43 % ± 1.25%，而shRNA轉染組細胞在阿霉素作用6小時后，K562、K562/A02細胞凋亡率分別是空載體組的1.30倍和3.84倍，可見下調Chk1的表達后， K562/A02細胞凋亡率上升更顯著（P<0.05）（圖4）。

討論

腫瘤細胞耐藥機制非常復雜，其中一個重要機制是細胞周期檢測點的活化參與了耐藥的形成。尤其是G2/M期檢測點的活化，其作用尤為突出，因為 ① 許多抗腫瘤藥物作用于細胞周期； ②絕大部分腫瘤細胞具有獲得性的G1/S期檢測點缺陷，而依賴于G2/M期檢測點的保護功能，腫瘤細胞的這種特性使其有別于正常細胞，也提示G2/M期檢測點是一個潛在的腫瘤治療的特異性靶點［5］； ③與多藥耐藥相關的P糖蛋白(Pgp)的逆轉劑除了增加細胞內藥物濃度外，其細胞毒作用也與G2/M期的阻滯解除有關［6］。因此，與G2/M期阻滯相關的細胞周期檢測點激酶Chk1、Chk2起重要作用。但有文獻報道，在P53缺陷的腫瘤細胞中，是Chk1而非Chk2參與了細胞的損傷反應［7］，故探討Chk1在腫瘤細胞耐藥機制中的調控尤為重要。 本研究發現，在阿霉素誘導下，耐藥細胞株K562/A02的G2/M期阻滯明顯較敏感細胞株K562延長， 這一現象與Chk1磷酸化水平升高密切相關，但與Chk1mRNA表達水平無關；下調Chk1的表達后，K562/A02細胞凋亡率增加了近3倍，較K562細胞增加顯著，此結果與相關文獻報道較為一致［4，8］。因此，活化的Chk1通過延遲細胞進入有分裂期以修復受損的DNA，從而提高細胞的增殖活性，且活化水平的高低使不同的細胞表現為程度不一的抗藥性；而G2/M期阻滯的解除更有利于增強DNA損傷劑對耐藥細胞的殺傷活性。上述結果表明，Chk1磷酸化水平是影響腫瘤細胞耐藥性的重要因素。但它又是如何影響隨后的DNA修復及修復后細胞周期的恢復，其機制尚不清楚。故對此方面研究將為闡明腫瘤細胞的耐藥機制提供有意義的材料。此外，本課題將質粒載體構建的Chk1shRNA導入靶細胞，使其在細胞內高效轉錄，實現了良好的抑制效果。與反義寡核苷酸和Chk1小分子抑制劑(咖啡因、UCN01等)相比，RNA干擾(RNA interference， RNAi)誘導的基因沉默顯示了其高穩定性、高效率性、高特異性、高穿透性、低毒性等優點，使其在腫瘤基因治療中有著良好的應用前景［9］。總之，細胞周期G2/M檢測點是腫瘤細胞有別于正常細胞的一個保護機制，因此對于其效應分子—Chk1在白血病細胞耐藥機制中作用的研究將為難治性、復發性白血病的治療提供新的靶點，而RNA干擾技術與常規抗腫瘤治療結合可能為克服腫瘤細胞耐藥提供新的有效治療途徑。

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