【摘要】 腫瘤細胞產生耐藥性成為許多腫瘤治療成敗的關鍵，也是血液腫瘤化療失敗的重要原因，目前人們從不同的角度和水平對耐藥的發生機制、逆轉耐藥的藥物研究及相應的體內外實驗等進行研究，指出多藥耐藥是多種因素共同作用的結果。近年來白血病的不典型耐藥機制日益受到人們的重視，因此本文從DNA拓撲異構酶和端粒酶與白血病耐藥的關系出發，闡述了白血病細胞多藥耐藥的抗凋亡機制，旨在為逆轉白血病耐藥及開發有效的逆轉劑奠定理論基礎。

【關鍵詞】 DNA拓撲異構酶 端粒酶 白血病 多藥耐藥

DNA Topoisomerase and Telomerase Activity with Relation to MultiDrug Resistance in Leukemia ——Review

AbstractThe appearance of multidrug resistance becomes a key to treat many malignanccies， and also is an important factor in the failure of chemotherapy. Presently， the studies on multidrug resistance mechanism， reversor and associated exterior experiments in vivo and in vitro from different points of view and levels show that multidrug resistance is the result of common action in many factors. In recent years nonrepresentative mechanism of multidrug resistance becomes more and more significant. This review aims at establishing rationale basis for reversing multidrug resistance of leukemia and finding effective reversors by expounding the mechanism of apoptosis in drug resistance of leukemia with relation to DNA topoisomerase and telomerase activity.

Key wordsDNA topoisomerase; telomerase; leukemia; multidrug resistance

多藥耐藥(multidrug resistance， MDR)是指腫瘤細胞或白血病細胞對一種化療藥物產生耐藥后對其它結構、細胞靶點和作用機制不同的多種抗癌藥物產生交叉耐藥的現象。血液腫瘤化療失敗的重要原因之一就是白血病細胞對化療藥物的不敏感性即多藥耐藥性。目前白血病細胞多藥耐藥的機制主要有多藥耐藥基因（mdr1基因）及其編碼的P糖蛋白（Pglycoprotein，Pgp）的過度表達；凋亡調控基因表達失控及相關酶的異常如谷胱甘肽酶活性增高，拓撲異構酶Ⅱ（ＴopoⅡ )含量的改變等。此外，許多研究表明惡性血液病細胞中端粒酶活性增加亦會影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。因此，本文就DNA拓撲異構酶和端粒酶與白血病細胞多藥耐藥的關系作一綜述，探討不典型耐藥機制在血液腫瘤中的作用，從而為克服耐藥的發生，開發有效的逆轉劑，提高臨床療效提供理論思路。

白血病細胞耐藥與凋亡的關系

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，由基因調控的主動的死亡過程。許多研究表明，某些抗腫瘤藥是細胞凋亡的誘導劑，因此抗凋亡也許是限制某些化療藥物的有效性的主要因素。白血病細胞的多藥耐藥性可分先天性耐藥與獲得性耐藥兩大類。由于白血病的高復發率使獲得性耐藥成為治療中的主要障礙，一般高劑量的化療藥物由于其非特異性及強的骨髓抑制等副作用限制了臨床應用，而低劑量通常會使治療效果不理想，并且導致病人的復發和腫瘤細胞逃避藥物的毒性作用而導致耐藥的產生。因此， 在防止不發生耐藥的情況下，用相對低的既能抑制腫瘤細胞的增殖又對病人損傷小并能取得治療療效的化療藥物劑量的是人們追求的目標，而誘導腫瘤細胞凋亡以增強化療藥物的敏感性成為目前研究的重點之一。Xu等［1］探討了白血病細胞多藥耐藥與細胞凋亡的關系，指出細胞的耐藥性與凋亡抑制相關，誘導細胞凋亡能減低白血病細胞的MDR。DNA拓撲異構酶和端粒酶與白血病細胞的凋亡有密切的關系，同時對化療的敏感性與病人的預后判斷有著重要的指導意義，二者在耐藥機制探討及逆轉劑的研究中有重要的價值。

DNA拓撲異構酶與凋亡

DNA拓撲異構酶(topoisomerase， Topo)是一種凋亡相關的、可催化DNA拓撲結構變化的核酸酶，它與DNA分子結合成“可斷裂復合物”，介導DNA鏈的瞬間斷裂與解螺旋后重接，在DNA的復制、基因轉錄、基因的修復與重組等方面發揮重要的作用。DNA拓撲異構酶分為DNA拓撲異構酶Ⅰ(TopoⅠ)和Ⅱ(TopoⅡ)兩種類型，二者分別催化ＤＮＡ單鏈與雙鏈斷裂再連接，均為抗癌藥物作用的靶點，其中TopoⅡ是近年來研究最多的與染色質凝集和結構有關的核蛋白，它對分裂后期染色單體的正常分離及細胞遺傳成分均等進入子細胞等生命活動十分關鍵。TopoⅡ能促使酶DNA易解離復合物形成，最終引起腫瘤細胞凋亡或死亡，其表達水平的下降可嚴重影響腫瘤對化療的敏感性，其同工酶TopoⅡa作為細胞內的重要核酶參與了MDR的形成，其活性降低亦可影響許多抗癌藥藥效。Aoyama等［2］用對VP16敏感的HL60細胞及其耐藥的HL60/DOX0.05細胞為對象，研究TopoⅡ抑制劑VP16誘導的DNA損傷與凋亡，并探討了鈣鈣調節蛋白依賴酶抑制劑KN62對其作用的調節。結果表明，KN62調節VP16誘導HL60細胞凋亡僅在半數抑制濃度的S期；而在HL60/DOX0.05細胞，非細胞毒劑量2 μmol KN62可顯著增加VP16的凋亡率，并且分別出現在G1、S和G2+M整個細胞周期，進而說明產生這種現象的機制與藥物穩定DNA斷裂復合體形成有關，KN62逆轉耐藥的效應在于以細胞周期依賴的方式，作為VP16的潛在增敏劑誘導DNA損傷與凋亡。有人進而用流式細胞術研究在VP16誘導白血病細胞凋亡過程中，藥物對HL60細胞細胞周期的影響與線粒體轉膜電位變化之間的關系：低濃度VP16（0.25-0.75 μmol）作用HL60細胞24小時，可使大量細胞停留在G2/M期，使線粒體膜電位顯著增加，在0.75 μmol時，G2期細胞從16%增加到95%，G1和S期細胞逐漸減少；高濃度VP16（2-3 μmol）作用后，G2期細胞消失，在VP16濃度≥1 μmol時，細胞出現凋亡且呈細胞周期依賴性，線粒體膜電位則降低，這說明細胞周期的變化與線粒體膜電位的改變有相關性［3］。Meng等［4］探討salvicine干擾TopoⅡ誘導細胞凋亡的可能機制，結果發現salvicine可誘導HL60細胞DNA損傷及早期DNA鏈斷裂而啟動凋亡過程，其引起DNA鏈斷裂在凋亡調控基因cmyc的P2啟動子區，從而抑制cmyc的表達，還可以誘導cfos和cjun基因轉錄的顯著增加，并伴隨有核小體間DNA ladder形成，這說明DNA損傷，尤其是某些基因特定區損傷是誘導細胞凋亡的早期信號，進而表明P2啟動子的失活是抑制cmyc表達和腫瘤細胞生長的有效途徑，Melixetian等［5］研究耐藥的分子機制與染色體不穩定性的相關性，指出與親代細胞相比較，對VP16耐藥的細胞株K562/ VP 16及其克隆K562/VP161、K562/VP16 2 DNATopo Ⅱa的基因表達水平分別下降了84%、63%及87%，且三者均有抗凋亡基因bcl2 mRNA含量減少，凋亡前基因bax mRNA水平下調到無法測出，bclXL mRNA水平僅在K562/VP161細胞株顯著減少，且在培養的早期，易于發生染色體的多倍體化，Topo Ⅱa表達水平的變化與K562/ VP 16細胞染色體的多倍體化發生率的增加呈正相關，從而證明了bcl2家族和Topo Ⅱa的表達的改變及染色體多倍體化的高發生率與K562細胞對VP16的獲得性耐藥有關。Dassonneville等［6］用Topo Ⅱ抑制劑——海水生生物堿ASC（ascididemin）對人Topo Ⅰ和Topo Ⅱ DNA鏈斷裂的影響來研究其對白血病細胞的凋亡誘導作用，超螺旋DNA解旋實驗表明，ASC可通過Topo Ⅱ促使DNA雙鏈的斷裂，對Topo Ⅰ僅有很微弱的作用，并且對敏感的HL60細胞及其耐藥株HL60/Mito均有毒性。細胞周期分析表明，經ASC處理后亞G1期細胞從3%增加到70%，同時G1期細胞則顯著地下降，進而證明了凋亡的誘導與caspase3的活化有關。LarocheClary等［7］用Topo Ⅱ抑制劑胺苯丫啶（amsacrine）、阿霉素、VP16對凋亡誘導作用的研究來闡明bcrabl表達在啟動凋亡中的作用，結果表明胺苯丫啶與阿霉素在半數抑制濃度下，能使K562細胞bcrabl及abl基因表達最多減少20%，而對阿霉素耐藥的K562細胞，胺苯丫啶可使bcrabl的表達下降80%，阿霉素則使其下降60%，二者均對正常的abl基因無作用；此外，胺苯丫啶還對敏感及耐藥細胞bclXL的表達有影響，但作用濃度高于其IC50值，VP16則對凋亡基因的表達均無影響，進而強調了bcrabl在使白血病細胞抗凋亡的過程中有重要的作用。Ｔopo Ⅱ與腫瘤的發生發展及治療和預后等方面有較密切的關系，其基因轉錄速度降低，等位基因甲基化或基因突變均可影響其表達，同時耐藥的發生亦影響其療效，開發對腫瘤特定的DNA拓撲酶抑制劑，誘導細胞凋亡及減少MDR發生有重要的意義。

端粒酶與凋亡

端粒酶是一種由催化亞單位(human telomerase reverase transcriptase， hTERT)、RNA模板(human telomerase RNA，hTR) 和端粒酶相關蛋白1(telome rase associated protein 1，TP1)組成的核蛋白復合體，能以自身RNA為模板，合成（TTAGGG）重復序列，使真核細胞染色體末端的端粒長度免于降解和熔接，與腫瘤的形成和耐藥有關。研究表明，包含模板區的結構RNAｈTR和發揮逆轉錄活動的催化亞單位hTERT是促進酶活動的兩大亞單位［8］，其中hTR構成性表達在正常和腫瘤組織中［9］，而hTERT只表達在生殖細胞（germ line）和某些干細胞，并且幾乎在腫瘤來源的永生化細胞中都表達。因此，hTERT與端粒酶活動關系密切［8］。端粒酶作為腫瘤細胞永生化的標志，降低其活性與誘導凋亡在逆轉耐藥中有重要的作用。Akiyama等［10］分別用hTERT和cMyc轉染紅白血病細胞K562。結果表明，hTERT轉染的K562細胞對DNA合成抑制劑阿糖胞苷、羥基脲誘導的凋亡敏感，但對去除血清或雙鏈DNA斷裂誘導劑VP16等誘導的凋亡產生耐受，指出通過轉染hTERT，使端粒酶過度表達，可導致端粒延長及對雙鏈DNA斷裂誘導劑的耐受。Zhang等［11］研究對復發和難治性早幼粒細胞白血病治療有效的三氧化二砷（As2O3）與端粒酶抑制劑DODC（3，3，diethyloxadicarbocya nine）對細胞凋亡的作用，指出低劑量的As2O3可使細胞停留在G2/M期而誘導細胞的凋亡，DODC能以劑量依賴的方式抑制端粒酶的活動，使細胞停留在G0/G1期，其單獨雖不能誘導凋亡的發生，但與As2O3合用可增加后者誘導凋亡的效應，從而為二者在臨床中聯合應用減少砷劑的毒副作用，發揮后者在癌癥治療中的潛能提供了有用的信息。Malerba等［12］探討作用機制不同的紫杉醇和VP16對人骨髓細胞及人早幼粒白血病細胞株HL60的凋亡及其相關基因bcl 2、bax、bclx等表達、端粒酶活性及端粒長度的影響，結果表明在骨髓基質細胞中二藥均可增加端粒的長度，并且伴隨有bax、bclx、 bcl2表達的變化，紫杉醇可活化端粒酶，延長端粒，增加HL60細胞的穩定性而誘導耐藥的發生；低濃度的VP16可活化端粒酶，而高濃度可使端粒酶的活性降低，下調bcl2，誘導HL60細胞凋亡與壞死。作者指出，端粒酶活性與凋亡有相關性，且二者似乎被共同的基因bcl2所調節。Liu等［13］研究抗癌藥物誘導白血病細胞凋亡過程中端粒酶的調節機制，指出Topo Ⅱ抑制劑salvicine能以時間和濃度依賴的方式通過下調端粒酶的活性而誘導HL60細胞的凋亡，并且端粒酶活性的抑制先于其催化亞單位hTERT和端粒酶相關蛋白1TP1 mRNA水平的下降，表明除了端粒酶亞單位轉錄水平的下降外，salvicine誘導的端粒酶活性的下降可被其它制劑所調節，進而發現蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸（okadaic acid， OA）可阻止salvicine誘導的凋亡并且下調端粒酶活性，而salvicine誘導的蛋白磷酸酶2A（PP2A）明顯增加可完全被OA所抑制，這些結果表明，salvicine誘導的端粒酶活性的下降不是HL60細胞凋亡的結果，也許主要是由PP2A活化介導的端粒酶成分的去磷酸化而引起的。Gunduz等［14］研究含有180多種包括類黃酮、石碳酸及石碳酸酯等成分的馬尼薩蜂膠對急性T淋巴細胞白血病細胞株CCFRCEM端粒酶活性的影響，結果表明與對照組相比，蜂膠處理組細胞的hTERT比率在72小時內從195.56降至13.29，尤其在第一個24小時內下降最顯著，分別達93%和60%，這表明蜂膠也許通過減少hTERT的水平抑制端粒酶的表達而發揮其抗腫瘤誘導細胞凋亡的效應，說明白血病細胞的凋亡與端粒酶hTERT表達關系密切。有人研究白血病細胞HL60凋亡過程中，凋亡調控基因bcl2表達與端粒酶活性的關系，證明了樺木醇酸的衍生物23羥基樺木醇酸可作為一種有效的細胞毒藥物，以劑量和時間依賴的方式抑制細胞增殖，誘導細胞的凋亡，且凋亡過程中伴隨有端粒酶活性的下降和bcl2表達的下調［15］。Liu等［16］研究α干擾素（αIFN）聯合阿糖胞苷（AraC）對白血病K562細胞的誘導凋亡作用及其作用機制，觀察了細胞端粒酶活性及凋亡調節基因P53蛋白的表達水平的變化，結果顯示，10 mg/L以上的AraC作用24小時后均能不同程度的升高P53蛋白的表達水平，20 mg/L的AraC作用72小時后，P53蛋白的表達水平可達30%左右，其與αIFN聯用可顯著抑制細胞的生長，降低端粒酶活性，升高P53蛋白的表達水平，誘導凋亡的發生。同年，他們又探討了具有廣泛抗腫瘤作用的冬凌草甲素（oridonin）對B淋巴細胞白血病細胞株Raji細胞的增殖抑制作用及其機制，分別用8、16及24 μmol/L濃度藥物作用不同時間，結果發現作用48-60小時后凋亡細胞數量達高峰，且在凋亡過程中端粒酶活性下降，并呈現出一定的時間效應與劑量效應關系［17］。端粒酶活性增高與腫瘤的發生、發展密切相關，造血細胞增殖、分裂和失控是白血病生物學的重要特征之一，在不同類型的白血病及同一白血病的不同階段，其活性各不相同，細胞凋亡是白血病細胞耐藥的機制之一，研究其活性變化與凋亡的關系有著重要的意義，可為開發有效的低毒高效的逆轉劑及臨床應用提供理論依據。在許多白血病中可發現有細胞遺傳學的改變，隨著腫瘤細胞的無限增殖，端粒酶不斷合成染色體末端的端粒而保持其永生化，拓撲異構酶是核基質成分之一，是一種調整DNA拓撲結構的核酶，參與了染色體組裝、基因組復制及DNA重組等，因此端粒酶與拓撲異構酶在一定程度上使染色體發生突變而影響治療的效果，導致耐藥的發生。Serakinci等［18］研究發現，端粒酶陽性的病人初次治療時染色體檢查核型是正常的，17個月后再次檢查發現多個染色體發生突變。誘導細胞的凋亡是逆轉白血病細胞對化療藥物耐受的一條重要機制，拓撲異構酶和端粒酶與細胞的凋亡關系密切，二者作為白血病治療的靶點有廣闊的應用前景。目前，端粒酶活性的變化與白血病細胞凋亡的關系尚未完全闡明，是端粒酶活性降低導致腫瘤細胞發生凋亡，還是細胞凋亡后繼發端粒酶活性下降，這一問題有待進一步研究。 現在普遍認為，拓撲異構酶抑制劑可導致Topo Ⅱ活性和含量的下降，導致腫瘤細胞DNA復制障礙，引起凋亡而達到抗腫瘤目的，但Topo Ⅱ活性和含量的降低又使得抗腫瘤藥喪失了作用目標并產生耐藥，因此需進一步加強對其作用機制的研究，為耐藥機制的闡明及有效逆轉劑研究提供新途徑。

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