作者：董寶俠，陳協群，王哲，梁蓉，白慶咸，黃高昇，張偉平，高廣勛，韓冬梅

【摘要】 本研究利用基因芯片技術檢測白血病多藥耐藥細胞株HL-60／VCR及其親本細胞株差異基因表達譜，探討急性白血病多藥耐藥機制。本試驗提取白血病細胞株HL-60及其多藥耐藥細胞株HL-60/VCR的 mRNA，在反轉錄及體外轉錄過程中分別用生物素進行標記，與Affymetrix公司人類全基因組芯片U133A雜交，用Affymetrix專用芯片掃描儀G2500A GeneArray Scanner及Microarray Suite 、Micro DBTM GeneChip LIMS、GeneChip DMT分析軟件系統處理雜交信號獲取結果。結果表明：白血病細胞株HL-60及其耐藥株HL-60/VCR差異顯示基因5 507條，其中耐藥細胞株中上調表達基因3 100條，下調表達基因2 407條；差異極顯著性基因 1 040條，表達上調435條，下調605條，涉及與細胞生長活動及信號轉導相關的基因。結論：多基因參與白血病細胞株的多藥耐藥機制，基因芯片技術是并行分析多個基因、探討白血病多藥耐藥機制的有效方法。

【關鍵詞】 基因芯片

Difference of Gene Expression Profiles between HL-60/VCR and HL-60 Cells Detected by Human Genome Genechip

Abstract This study was aimed to detect the gene expression profile changes between human acute leukemia cell line HL-60 and VCR-resistance HL-60，and to investigate the underlying mechanisms of MDR by using genechip technology. In experiments，mRNA were harvested using TrizoL reagent from these two cell lines，through RT-PCR，the biotinylated nucleotide were incorporated into the cRNA during the in vitro transcription reaction. The high quality RNA was hybridized to the gene expression array ——human genome U133A developed by Affymetrix. It was scanned by G2500A GeneArray Scanner and the acquired image was analysed by a series of softwares. The results showed that 5 507 genes were differentially expressed between human acute leukemia cell line HL-60 and VCR-resistant HL-60. Compared with HL-60，3 100 genes were up-regulated and 2 407 genes were down- regulated in VCR-resistant cell line. These genes were involved in different cell activities such as growth regulation and signal transduction. Among the genes with remarkable differential expression between the two cell lines，435 were up- regulated and 605 were down- regulated. It is concluded that many different kinds of genes are involved in the mechanism of MDR and there is an intricate molecular network that controls the sensitivity of leukemia cells to the chemotherapeutic agents. Genechip is an efficient tool for parallel gene expression analysis.

Key words genechip; multidrug resistance; leukemia; HL-60; HL-60/VCR

基因芯片技術是近年來計算機技術與生物學技術交叉的產物。它通過使用微加工、微電子技術及其他相關技術，在固體表面合成大量探針，利用生物大分子DNA的結構及其堿基配對原則，實現對核酸分子中基因片段的準確、快速、大信息量的檢測。化療是治療急性白血病的主要手段，而白血病細胞對化療藥物的原發或繼發耐藥是導致化療失敗的根本原因。白血病的多藥耐藥現象是導致白血病復發及化療失敗的主要原因。目前發現的腫瘤多藥耐藥機制主要涉及P-gp﹑MRP﹑LRP﹑BCRP、GSH/GST﹑PKC、TopoⅡ、DNA修復、多種凋亡相關基因和腫瘤細胞生活的內外環境（如pH、缺氧、溫度）變化。但白血病MDR的機制并非單一，它錯綜復雜，以網絡的形式相互作用并相互制約，且在臨床上根據現有的MDR機制采取的逆轉耐藥措施并不十分有效。基因芯片為我們提供了進行觀察、分析不同種類基因與白血病耐藥相互關系的平臺，為進一步探討腫瘤耐藥機制、臨床尋求有效逆轉耐藥方法創造了條件。我們選用Affymetrix公司人類全基因組芯片U133A［8］，對急性白血病耐VCR細胞株與其親本細胞株差異表達基因進行篩選和分析。

材料和方法

藥品

長春新堿（VCR）購自美國Sigma公司，柔紅霉素、阿糖胞苷購自 Pharmacia-Upjohn公司，拓樸替康為貴州漢方制藥廠產品，米托蒽醌為四川升和制藥有限公司產品，羥基喜樹堿為黃石飛云制藥廠產品，足葉乙甙為連云港制藥廠產品。以上藥物用無菌生理鹽水稀釋、過濾并分裝，-20℃保存備用。PgP單克隆抗體為Immunotech公司產品，TrizoL為Gibco公司產品，基因芯片HU-133A購自Affymetrix公司，其上包括18 000個明晰的轉錄本。

細胞培養

急性髓細胞白血病細胞系HL-60系ATCC細胞株為本校病理教研室保存株。HL-60耐長春新堿（VCR）細胞株HL-60／VCR由美國紐約 Memorial Sloan-Kettering癌癥研究所引進，培養于含10％ 滅活小牛血清的RPMI 1640培養液（含青霉素、鏈霉素各0.1 U/L）中，置于5％ CO2、飽和濕度、37℃培養箱中懸浮培養。2-3天換液1次。HL-60／VCR細胞培養液中VCR濃度為250 ng/ml，實驗所用細胞均為脫離藥物馴化2周后的對數生長期細胞。

HL-60／VCR優勢克隆的有限稀釋法挑選

調整HL-60／VCR細胞濃度至5×103 ／ml，將此懸液經100倍稀釋，即為50細胞／毫升；再將50細胞／毫升的細胞懸液經5倍稀釋，即為10細胞／毫升；最后將10細胞／毫升的細胞懸液經2倍稀釋，即為5細胞／毫升。將3種稀釋好的細胞懸液分別接種于96孔板中，每孔加液0.1 ml，然后放入培養箱內培養。

HL-60／VCR細胞株的體外藥物敏感試驗

采用MTT 細胞毒實驗法。 對照組為HL-60細胞，處理組為HL-60/VCR，調整細胞濃度為2×104／ml，按每孔100 μl，接種于96孔板，37℃、5﹪ CO2孵育過夜，次日加入含不同濃度藥物的培養液100 μl。化療藥物分別以1 ng/ml、3.2 ng/ml、10 ng/ml、32 ng/ml、100 ng/ml、320 ng/ml、1000 ng/ml、3 200 ng/ml、10 000 ng/ml、32 000 ng/ml濃度分為10組，每組設4個平行孔。加藥后培養72小時，每個孔加入MTT(5 g/L) 20 μl，繼續孵育4小時，離心，去上清，每孔加入150 μl二甲亞砜（DMSO），用平板振蕩儀振蕩10分鐘，在酶聯免疫檢測儀測定A490 nm值，并計算細胞存活率(處理組A490 nm/ 對照組A490nm×100﹪)，實驗重復3次，繪制劑量效應曲線，求出半數抑制劑量(IC50)。耐藥指標采用逆轉倍數和相對逆轉率。

細胞周期的檢測

以2×104/ml密度將對數生長期細胞HL-60細胞及HL-60/VCR(脫藥2周后) 接種于6孔板，分別于48小時后收集細胞（ 細胞數約＞ 1×106），用預冷的PBS洗2次，離心去上清后，加入1 ml PBS和 2 ml無水乙醇固定過夜，加入DNA-Prepstain染液染色后，用ELITE ESP流式細胞儀（FCM Coulter 公司）檢測各組細胞的熒光強度，每份樣品檢測約5 000細胞，用DNA Multi Cycle軟件（Beckman Coulter）進行統計學分析，得到各個組細胞周期時相。

P170蛋白表達的Western blot檢測

按分子克隆方法，分別提取HL-60細胞及HL-60/VCR細胞總蛋白，經紫外分光光度法定量后，各組取等量總蛋白進行8％SDS－PAGE電泳并轉移到PVDF膜上，膜用封閉液（blocking buffer） (TBS+1% BSA+0.05% Tween 20) 封閉1小時，加入Pgp (1∶100稀釋)單克隆抗體4℃過夜，次日37℃復溫1小時，TBST洗膜，兔抗小鼠IgG-過氧化物酶二抗室溫孵育1小時，TBS洗膜后DAB顯色。

細胞內柔紅霉素濃度的測定

實驗分為2組:HL-60 細胞組和HL-60/VCR細胞組; 調整各組細胞濃度為 1 × 106 /ml，同時加入DNR至終濃度為10 mg /L，60分鐘后加入等體積預冷的PBS以終止細胞代謝，用冷PBS洗滌2次，立即用流式細胞儀測定細胞內DNR被激發的相對熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為575 nm，以熒光任意單位的對數值表示DNR濃度。

HL-60／VCR及其親本細胞株差異基因表達譜基因芯片技術的研究

用TrizoL試劑分別提取HL-60及HL-60/VCR細胞的總RNA，并檢測其質量濃度及A260／280值。按照Affymetrix公司方法進行反轉錄、體外轉錄（同時進行生物素標記）合成cRNA探針、基因芯片雜交、洗脫、染色和檢測。芯片掃描所得數據用Affymetrix Microarray Suite software 5.0進行計算和處理。

統計學分析

組間比較采用t檢驗。

結果

HL-60／VCR優勢克隆的形成

細胞培養1周左右，96孔板孔中即形成較大克隆，待克隆長至孔中培養液體積的1／3后將細胞轉種于24孔培養板擴大培養。細胞甩片并進行瑞氏-姬姆薩染色，可見篩選出的HL-60／VCR細胞體積明顯大于HL-60細胞，胞形不規則，核仁更為明顯（圖1，2）。

HL-60／VCR體外藥物敏感試驗

HL-60/VCR細胞對多種化療藥物的IC50值明顯大于HL-60細胞（耐藥倍數為7-251.2）。逆轉效率的高低與化療藥物種類有關，其中以DNR、TPT的耐藥倍數較高（附表）。

細胞周期的檢測 流式細胞儀檢測顯示，HL-60細胞主要聚集于S+G2期，而其耐VCR細胞主要聚集于G1期（圖3、4）。

Western blot檢測

Western blot 檢測顯示，HL-60/VCR細胞株高表達P170糖蛋白，而HL-60細胞株未見表達P170糖蛋白（圖5）。

HL-60/VCR細胞內DNR的蓄積

HL-60細胞和HL-60/VCR細胞內DNR濃度差別很大，前者蓄積能力強，細胞內DNR平均熒光強度為12.1，后者蓄積能力低，細胞內DNR平均熒光強度為8.69（P<0.05)(圖 6，7)。

基因芯片對HL-60／VCR及其親本細胞株差異表達基因的生物信息學分析 利用基因芯片HU-133A對來自HL-60、HL-60/VCR細胞株進行檢測的結果是：在總共22 283個探針池中，HL-60組檢測到了10 707個，占總數的48.1％；HL-60/VCR組檢測到了11 248個，占 50.5％。進一步運用Affymetrix 公司提供的分析軟件Affymetrix Microarray Suite software 5.0對兩個樣品的芯片檢測所得數據進行處理，結果發現：與HL-60細胞株比，HL-60/VCR細胞株檢測到有3 058個基因表達上調，其中上調倍數大于2倍的有435個；表達下調的基因共有696個，其中有605個基因的下調倍數大于2，它們分別是與細胞分化、凋亡等生長活動相關的調節因子及信號轉導相關基因。基因表達譜的散點圖見圖8。圖中的每一個點代表1個基因，X軸和Y軸分別代表基因在HL-60細胞中和在HL-60/VCR細胞中表達的信號強度。沒有差異表達的基因分布在以管家基因均衡后的斜線周圍，遠離斜線的為差異表達（上調或下調）的基因及陽性對照。

在上述的差異表達基因中，芯片ID號為39729-at（GenBank號為L19185）的基因NKEFB，在HL-60/VCR細胞株中表達水平除mdr1外其上調最為顯著（與HL-60細胞株相比上調了335倍）。

白血病的多藥耐藥是一種復雜的多基因相關現象［1-3］，有關其分子機制仍然不是很清楚。針對多藥耐藥相關基因如mdr1所采取的逆轉耐藥措施目前經臨床證實仍不能有效解決耐藥問題。尋找新的耐藥相關基因，揭示耐藥機理，進而發展新的逆轉耐藥方法，這無疑是非常必要的。本實驗誘導并維持HL-60/VCR細胞系的耐藥性，MTT法測定其耐藥倍數，Western blot法鑒定P170分子的存在，流式細胞儀鑒定P170分子泵的功能，比較白血病細胞HL-60和長春新堿耐藥細胞HL-60／VCR二者在細胞周期上的差異，明確耐藥細胞株的耐藥特性。由于傳統篩選差異功能基因的方法如消減雜交、差示PCR等具有篩選基因有限、假陽性率高等缺點，所以我們選擇了Affymetrix 公司提供的人類全基因組芯片U133A，高通量、平行分析了髓系白血病細胞株HL-60及其耐藥細胞株HL-60/VCR，并通過比對以尋找新的耐藥相關基因。我們發現，在耐藥細胞株中明顯上調的基因有435條，明顯下調的基因有605條，其中NKEFB基因上調尤為明顯，幅度僅次于mdr1基因。有研究表明，此基因編碼一組抗氧化酶，可抵抗過氧化氫及烷基過氧化氫的氧化作用；所編碼蛋白具有保護細胞抗氧化的作用，也可有助于CD8+ T細胞的抗病毒作用；此蛋白還有助于腫瘤的增殖及發展［11］。關于此基因究竟是否參與了血液病細胞多藥耐藥的形成，其他所篩選差異基因與多藥耐藥機制的相關程度的相關研究正在進行中。

【