作 者：崔晶，丁璟，吳軼蘋，劉復強，劉小超，王陽

【摘要】 本研究探討亞硒酸鈉對白血病耐藥細胞株K562/ADR細胞的多藥耐藥性的逆轉作用及其逆轉機制。 用噻唑藍（MTT）法檢測亞硒酸鈉對K562/ADR細胞的生長抑制作用及其對K562/ADR細胞耐藥性的逆轉作用；應用流式細胞儀檢測亞硒酸鈉對K562及K562/ADR細胞凋亡率的影響；用半定量RTPCR法檢測K562/ADR細胞中mdr1和bcl2基因的表達情況。 結果表明，10 μmol/L亞硒酸鈉可以明顯增加K562/ADR細胞對阿霉素敏感性，其耐藥逆轉倍數為2.31；早期凋亡率在10 μmol/L亞硒酸鈉作用于K562細胞48小時是升高的；而中、晚期凋亡率在亞硒酸鈉5、10 μmol/L作用48、72小時時均明顯升高；兩種濃度亞硒酸鈉在作用48小時可使K562/ADR細胞早期凋亡率增加，作用48、72小時可使K562/ADR的細胞中、晚期凋亡率增高，10 μmol/L的亞硒酸鈉所致凋亡率高于5 μmol/L，作用72小時的凋亡率高于48小時；亞硒酸鈉可使K562/ADR細胞mdr1 mRNA及bcl2 mRNA表達下降。 結論： 亞硒酸鈉可部分逆轉K562/ADR細胞的耐藥性，其機制可能是增加K562/ADR細胞凋亡率，下調mdr1 mRNA和bcl2 mRNA的表達。

【關鍵詞】 細胞凋亡

Reversal Effect of Sodium Selenite on Multidrug Resistance in K562/ADR Cell Line and Its Mechanisms

AbstractThis study was purposed to investigate the reversal effect of sodium selenite on multidrug resistance in adriamycinresistant leukemic cell line K562/ADR and its mechanisms. The cytotoxicity and the reversal effect of sodium selenite on K562/ADR cells were assayed by MTT method; the apoptosis rate of K562 and K562/ADR cells were detected by flow cytometery， the mRNA expressions of mdr1 and bcl2 were measured by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR). The results showed that 10 μmol/L sodium selenite significantly increased the cytotoxicity of adriamycin to K562/ADR cell and the reverse index（RI）was 2.31; the early apoptosis rate of K562 cells was elevated after treatment with 5 μmol/L Na2SeO3 for 48 hours；and the mediumterm and late apoptosis rate was elevated after treatment with both 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 for 48 and 72 hours. Both doses of 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 increased the early apoptosis rate of K562/ADR at 48 hours，and also increased the mediumterm and late apoptosis rate after treating for 48 and 72 hours. The apoptosis rate was higher at dose of 10 μmol/L than that at 5 μmol/L， the apoptosis rate at 72 hours also was higher than that at 48 hours. The expressions of mdr1 mRNA and bcl2 mRNA were decreased significantly by 10 μmol/L sodium selenite. It is concluded that sodium selenite can reverse the multidrug resistance in K562/ADR partially by downregulating the expressions of mdr1 mRNA and bcl2 mRNA， and increasing apoptosis rate of K562/ADR cells.

Key wordsNa2SeO3; K562/ADR cell; multidrug resistance; apoptosis

J Exp Hematol 2007; 15(4):756-761

白血病誘導化療失敗和緩解后復發(fā)的重要原因之一是白血病細胞耐藥性的形成。 多藥耐藥(multidrug resistance， MDR) 是化療耐藥的主要形式。對多藥耐藥性產生的機制及其逆轉的研究一直是腫瘤研究領域的一個熱點。目前備受關注的耐藥逆轉劑主要有鈣離子拮抗劑、環(huán)孢菌素A等，但這些藥物在體內應用時，因毒副作用過大很難達到體外實驗所要求的最佳逆轉濃度，因而未能廣泛應用于臨床。

硒作為人體必需的微量元素，能提高機體免疫力。已有研究報道，硒可增強某些抗腫瘤藥的化療效果，但關于硒是否可逆轉白血病細胞耐藥性的研究尚十分少見。本研究探討了亞硒酸鈉對K562/ADR多藥耐藥性的逆轉作用及逆轉機制，以期為臨床上應用硒制劑克服腫瘤細胞的多藥耐藥性，提高化療療效提供部分實驗依據。

主要試劑和材料

亞硒酸鈉、噻唑藍（MTT）及二甲亞砜（DMSO）為sigma公司產品。RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清（FBS）購自中國醫(yī)學科學院細胞中心。TRIzoL及RTPCR試劑盒購自北京博大泰克生物有限公司。mdr1、bcl2和βactin引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。CO2細胞孵育箱為Heraeus公司產品；Model 450酶標儀為BIORAD公司產品； PCR儀為Beckman公司產品；圖像分析儀為Serial公司產品）;流式細胞儀為美國Becton Dikinson公司產品。

白血病細胞株及實驗分組

敏感細胞株 K562和耐藥細胞株 K562/ADR均購自中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所。分別將兩種細胞株設立為A、B、C 3組，其中A組（對照組）不加藥，B組加亞硒酸鈉5 μmol/L，C組加亞硒酸鈉10 μmol/L。K562細胞為A1、B1、C1，K562/ADR細胞為A2、B2、C2。所有細胞均置含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5% CO2、飽和濕度。K562/ADR細胞的培養(yǎng)液中需加入1 μg/ml阿霉素，實驗前2周脫藥培養(yǎng)。

逆轉耐藥的MTT檢測

取對數生長期細胞，以1×105/ml的細胞懸液濃度接種于96孔板，每孔細胞的懸液為100 μl，加入不同濃度亞硒酸鈉及RPMI 1640培養(yǎng)液至每孔總體積達200 μl，每一藥物濃度設平行3孔，培養(yǎng)72小時后行MTT實驗。酶標儀570 nm處測吸光度值，計算細胞增殖抑制率和IC50。

細胞存活率 =（加藥組OD值/對照組OD值）×100%

細胞增殖抑制率= ［1-（加藥OD值/對照OD值）］×100%

IC50：細胞增殖抑制率為50%時的藥物濃度

耐藥逆轉倍數＝對照組IC50/試驗組IC50

細胞凋亡率的流式細胞術測定

取對數生長期的A、B、C 3組細胞，以2×105/ml的密度分裝到不同的培養(yǎng)瓶中，分別于48、72小時后加入長春新堿（VCR）5 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集細胞，分別用PBS洗細胞2次，懸浮于1×緩沖液中，再各取100 μl上述溶液加入新的培養(yǎng)管，分別加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，輕輕混合后置于暗處孵育15分鐘，加入400 μl 1×緩沖液到每個管中，于1小時內行流式細胞儀檢測。

mdr1和bcl2 mRNA表達水平的測定

取對數生長期細胞，調細胞濃度為1×105/ml。采用TRIzoL試劑提取總RNA，按試劑盒說明進行逆轉錄反應。 mdr1上游引物：5′CCCATCATTGCA ATAGCAGG3′，下游引物：5′GTTCAAACTTCTGC TCCTGA3′，擴增片段157 bp；bcl2上游引物：5′G AGACATCAGCATGGCTCAA3′，下游引物：5′G TCCAAGGTCATGGTTGTCC3′，擴增片段301 bp；βactin上游引物：5′GGACTTCGAGCAAGAGAT GG3′，下游引物：5′AGCACTGTGTTGGCGTAC AG3′，擴增片段為234 bp。共擴增35個循環(huán)，具體擴增條件及操作步驟按試劑盒說明進行。取10 μl擴增產物，置2%瓊脂糖凝膠（含EB 0.4 mg/L）上電泳。用圖像分析儀分析條帶，應用mdr1和bcl2與βactin基因條帶的密度比值計算表達強度。

統計學方法

采用t檢驗，用SPSS 11.0統計軟件進行分析。

結果

藥物濃度的選擇

當亞硒酸鈉濃度在 10 μmol/L以下時，與未加藥對照組相比，其對細胞生長無明顯的抑制作用（增殖抑制率<5%），故選擇亞硒酸鈉5 μmol/L和10 μmol/L作為實驗濃度。

亞硒酸鈉對K562/ADR細胞的阿霉素耐藥性的影響

阿霉素對K562和K562/ADR細胞作用72小時時的 IC50 值分別為： （0.049±0.002） μg/ml和（8.28±1.27） μg/ml，即K562/ADR細胞的耐藥性是K562的169倍。亞硒酸鈉對于K562細胞對阿霉素的敏感性無影響作用，對于K562/ADR細胞對阿霉素敏感性的影響見表1。

B組48和 72小時的IC50值分別為：（10.01±1.11）μg/ml 和（7.89±1.02）μg/ml；C組48和 72小時的IC50值分別為：（10.01±1.13）μg/ml 和（3.58±0.26）μg/ml。此實驗結果表明5 μmol/L亞硒酸鈉作用48和 72小時均不使K562/ADR細胞對阿霉素的敏感性明顯增加，耐藥逆轉倍數為1.03-1.05；10 μmol/L亞硒酸鈉在48小時對K562/ADR細胞對阿霉素的敏感性也無影響，在72小時可以增強K562/ADR細胞對阿霉素的敏感性，耐藥逆轉倍數為2.31倍。這提示亞硒酸鈉對K562/ADR的逆轉耐藥作用呈濃度和時間依賴性。

對K562和K562/ADR細胞株不同時間誘導凋亡及凋亡率的變化

硒對K562細胞凋亡的誘導 B1組和C1組的K562細胞在48、72小時總凋亡率較未加藥的A1組明顯升高（p<0.01），并且C1組總凋亡率高于B1組；72小時的總凋亡率高于48小時（表2）。5、10 μmol/L亞硒酸鈉作用48小時對K562細胞早期凋亡率沒有明顯影響，作用72小時早期凋亡率下降；而兩種濃度亞硒酸鈉在不同時間導致的中晚期凋亡率均明顯升高（p<0.01）（表3、表4，圖1、圖2）。

硒對K562/ADR細胞凋亡的誘導

實驗結果見表5。由表5可見，B2組和C2組的K562/ADR細胞在48、72小時總凋亡率較之未加藥組A2組明顯升高，并且在48小時C2組總凋亡率高于B2組。兩種濃度亞硒酸鈉在作用48小時可使K562/ADR細胞早期凋亡率增加，5 μmol/L亞硒酸鈉作用72小時早期凋亡率下降，10 μmol/L亞硒酸鈉作用72小時早期凋亡率沒有明顯變化。兩種濃度的亞硒酸鈉在48、72小時均可使耐藥K562細胞株中晚期凋亡率明顯增高（表6、表7，圖4、5）。

亞硒酸鈉對mdr1基因表達的影響

K562細胞無mdr1基因表達，mdr1與β actin基因條帶的密度比值為0； K562/ADR細胞mdr1基因為陽性表達，mdr1與β actin基因條帶的密度比值為0.474±0.002，A組和B 組分別下降至0.332±0.002和0.327±0.008，與未處理組相比差別有統計學意義（p<0.05）(圖5)。

亞硒酸鈉對bcl2基因表達的影響

實驗證明K562和K562/ADR細胞bcl2基因均為陽性表達，K562/ADR細胞表達水平略高。bcl2與βactin基因條帶的密度比值，在K562/ADR細胞為1.245±0.142，經5和10 μmol/L亞硒酸鈉預處理72小時后，比值分別下降至0.508±0.089和0.462±0.121，與未處理組相比差別有統計學意義（p<0.05），但未達到K562水平（0.441±0.075）(圖6)。

討論

實驗證實，K562/ADR細胞株是mdr1 基因高表達的細胞株［1］，其阿霉素IC50值為敏感細胞株K562/S阿霉素IC50值的169倍。本研究結果表明：亞硒酸鈉具有部分逆轉K562/ADR細胞對阿霉素的耐藥性，呈現為濃度和時間的依賴性。這一結果與Shallom等［2］關于硒可以增加鼠耐藥白血病細胞系P388/ADR對阿霉素敏感性的報道相近似，也與Caffrey等［3］報道亞硒酸鈉可以提高化療藥對鼠耐藥卵巢癌細胞毒性作用的結果相一致。

大量的研究表明，亞硒酸鈉對敏感的白血病細胞有抑制生長和誘導凋亡的作用。李劍等［4］以急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4細胞為研究對象，較系統進行了一系列有關細胞生長、凋亡及細胞內活性氧自由基、還原型谷胱甘肽含量的觀察。發(fā)現亞硒酸鈉低濃度(2 μmol/L)作用24小時后對NB4細胞生長無顯著的抑制作用，5 μmol/L以上濃度可以顯著地抑制NB4細胞的生長，有濃度依賴性。亞硒酸鈉誘導NB4細胞凋亡，可能是亞硒酸鈉抑制細胞生長的主要機理，同時這種作用呈時間和劑量依賴性。我們在亞硒酸鈉對K562細胞和K562/ADR細胞誘導凋亡的研究中發(fā)現：亞硒酸鈉可以誘導敏感細胞系K562凋亡，而這種誘導作用呈時間劑量依賴性。這與其他研究者的報道［5，6］也是一致的。

孫義民等［7］對急性白血病耐藥細胞株MR2細胞系的研究發(fā)現，亞硒酸鈉對細胞株的生長抑制作用呈劑量時間依賴性。亞硒酸鈉作用細胞一定時間后可使胞內自由基水平增加，并在24小時時出現最大值，提示了亞硒酸鈉對MR2細胞的生長抑制及凋亡誘導作用可能是通過氧化應激實現的。他們還發(fā)現，亞硒酸鈉也可以增加白血病耐藥細胞系K562/ADR對VCR的敏感性，使其凋亡率增加，并且也呈時間和劑量依賴性。王坤等［8］發(fā)現，低劑量硒不能誘導白血病細胞系HL60細胞的凋亡，高劑量硒具有顯著的抗腫瘤及誘導細胞凋亡的作用。1 μg/ml和2 μg/ml硒作用于HL60細胞48小時后與對照組和低劑量加硒組相比，凋亡百分率均明顯增高，這也提示硒誘導白血病細胞凋亡具有劑量依賴性。

研究發(fā)現，硒增加了VCR對敏感和耐藥K562細胞系誘導凋亡的作用，總凋亡率隨著作用時間和藥物濃度的增加升高，其中早期凋亡率下降，而中晚期凋亡率在48、72小時兩個時間段均明顯上升。這提示亞硒酸鈉不僅可以提高VCR誘導敏感白血病細胞凋亡，而且可以使K562/ADR細胞對VCR的敏感性增加，這種作用呈劑量和時間依賴性，而且隨著作用時間的延長，細胞的凋亡逐漸由早期凋亡過渡到晚期凋亡。

相關研究發(fā)現，硒可以通過下調bcl2，上調P53，激活Caspase等途徑引起凋亡［9，10］，從而抑制腫瘤細胞的生長。一些研究發(fā)現，bcl2基因家族蛋白表達水平的變化能顯著改變腫瘤細胞株對化療藥物誘導凋亡的敏感性［11，12］。bcl2基因為經典的凋亡抑制基因，其過度表達與白血病耐藥密切相關，并且在腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。bcl2作用于細胞凋亡途徑中許多信號匯集的某個環(huán)節(jié)，并通過此環(huán)節(jié)引起細胞對化療藥物的耐受。本研究進一步表明，亞硒酸鈉可下調K562/ADR細胞多藥耐藥基因（mdr1）及bcl2基因的表達，該結果與Xiao等［13］和Dong等［14］報道硒制劑可下調bcl2基因表達的結果是相一致的。據此推測亞硒酸鈉可能通過下調細胞中mdr1及bcl2基因的表達影響細胞凋亡，從而逆轉K562/ADR細胞耐藥性。白血病細胞多藥耐藥性的產生是多機制參與的，除mdr1和bcl2基因外，可能尚有其它機制（如MRP、LRP和拓撲異構酶等）的參與，故亞硒酸鈉逆轉K562/ADR細胞多藥耐藥性的詳細機制尚有待進一步探討。

硒是人體必需的微量元素。現代大量的流行病學調查、體外和臨床實驗研究均證實它對多種腫瘤都有顯著的預防作用［15］；有研究表明，硒是體內多種酶的構成成分，不同形式的硒對細胞周期蛋白激酶cdk2及蛋白激酶C有強烈的抑制作用，能誘導前列腺癌、肝癌和多種血液腫瘤細胞系的惡性細胞凋亡，能增強紫杉醇、柔紅霉素等抗癌藥化療效果［16］，減少化療藥的用量，減輕化療藥的毒副作用等。Frenkel等［17］報道硒可以預防卵巢癌細胞耐藥性的出現。本研究表明，亞硒酸鈉可以通過下調mdr1基因和bcl2基因，提高細胞凋亡率，達到部分地逆轉K562/ADR細胞的耐藥性。提高K562/ADR細胞對阿霉素的敏感性，提示亞硒酸鈉可以作為一種耐藥逆轉劑和化療增敏劑在抗腫瘤方面發(fā)揮作用。