作者：王漪，劉心，張海濤，余敏，王暉

【摘要】 本研究探討NFκB調控的血液腫瘤細胞抗凋亡機制中是否有mdr1的參與，并通過對NFκB的抑制希望獲得血液腫瘤的耐藥逆轉，為難治性白血病的治療探索一條新的道路。取不同終濃度的NFκB抑制劑PDTC作用的，或者同一濃度作用不同時間后的K562/A02細胞，分別用免疫組織化學加計算機圖像分析儀方法半定量檢測每1份樣本中NFκB的活性和Pgp的表達，以及用反轉錄多聚酶鏈反應方法半定量檢測每2份樣本中mdr1的活性，通過統計學來分析mdr1、Pgp的表達是否與NFκB的活化有關。結果表明：隨著NFκB抑制劑PDTC作用濃度的不斷升高、作用時間的不斷延長，K562/A02細胞NFκB/p65的表達不斷降低，Pgp和mdr1 mRNA的表達也逐漸降低，而且三因子之間均有顯著相關性。結論： 通過對K562/A02細胞高表達的NFκB的抑制可降低該細胞的mdr1 mRNA和Pgp的表達，從而提高血液腫瘤細胞的放化療敏感性。

【關鍵詞】 PDTC

NFκB Regulating Expression of MDR1 Gene and Pgp to Reverse Drugresistance in Leukemic Cells

AbstractThis study was purposed to investigate whether the mdr1 participates in antiapoptotic mechanisms of hematologic malignant cells regulated by NFκB and to explore the reversal effect of inhibiting NFκB on drugresistance of hematologic malignant cells so as to search a novel way for treatment of refractory leukemia. NFκB activity and Pgp expression in K562/A02 cells cultured with PDTC in different concentration or different time were detected by immunohistochemistry and computerized picture analysis. The mdr1 was detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction， and the relationship among NFκB ， Pgp and mdr1 was analyzed. The results showed that in K562/A02 cells the expression of Pgp and mdr1 were positively correlated with NFκB/p65， which showed the concentration and time dependent manner. It is concluded the mechanism of NFκB regulating antiapoptosis in K562/A02 cells has the correlation with the expression of mdr1 and Pgp. The expression of mdr 1 mRNA and Pgp can be reduced through inhibiting NFκB in K562/A02 cells， so that the sensitivity of chemical therapy can be enchanced on hematologic malignant cells.

Key wordsK562/A02； NFκB； PDTC； PGP； MDR1

J Exp Hematol 2007; 15(5):950-954

白血病的多藥耐藥性是導致化療失敗、疾病復發及難以根治的主要原因，是目前臨床上亟待解決的難題之一。新近研究發現mdr1及其產物Pgp高表達是耐藥的主要機制。白血病細胞MDR現象就是指白血病細胞mdr1基因及其產物Pgp過度表達導致細胞藥物外排增加，降低白血病細胞內化療藥物濃度，白血病細胞由此逃避化療藥物的殺傷而產生耐受現象［1］。因此，應用針對耐藥腫瘤細胞Pgp高表達的逆轉劑是解決耐藥的關鍵。現研究較多的一類基因調控子NFκB已被證實可調控多種實體瘤（乳腺癌、肝癌、結腸癌等）的mdr1基因表達。本實驗通過研究NFκB和mdr1在惡性血液病耐藥細胞株中的關系，明確NFκB調控的血液腫瘤細胞抗凋亡機制是否有mdr1的參與，并可提供在惡性血液病耐藥這一難題上一種可能的逆轉耐藥的途徑，預期應用此新方法，并與現有的其他方法聯合，會在逆轉白血病細胞耐藥中起顯著效果，為進一步提高血液惡性腫瘤的療效作出貢獻。

材料和方法

主要試劑

二硫氨基甲酸酞吡咯烷（Pyrrolidinedithiocarbamic PDTC）購自Alexis Biochemicals公司，先用無血清RPMI 1640培養液配制成10 mmol/L的貯存液，細胞干預前將貯存液用完全培養液稀釋成所需濃度。中國實驗血液學雜志 J Exp Hematol 2007; 15(5)白血病細胞中NFκB調控MDR1基因、P糖蛋白以及逆轉耐藥的研究兔抗人NFκB/p65多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。鼠抗人Pgp單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。SABC免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。TRIZOL reagent購自Invitrogen公司。反轉錄試劑盒購自MBI公司。2×PCR TaqMIX購自北京天為時代科技有限公司。

PCR引物

由Primer引物設計軟件設計，上海生物工程有限公司合成。 mdr1有義鏈引物： 5′CAAAGGAGGCCAACATAC3′（3870-3887）； mdr1反義鏈引物： 5′CTGCCATTCTGAAACACC3′（4156-4173） 擴增片段為304 bp。β2微球蛋白（β2MG）有義鏈引物： 5′TCCAGCGTACTCCAAAGA3′（122-139）； β2微球蛋白（β2MG）反義鏈引物： 5′ACGGCAGGCATACTCATC3′（346-363）擴增片段為242 bp。

細胞株及細胞培養

K562/A02耐藥細胞株購自中國醫學科學院血液學研究所藥理室。K562/A02細胞在含1 μg /ml阿霉素的培養液中培養，實驗前2周在無阿霉素的培養液中培養。所有的細胞株都在含體積分數為10%的小牛血清的RPMI 1640培養液中，于37℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養。實驗時均采用對數生長期細胞。不同濃度組加入含PDTC不同濃度的完全培養液培養12小時，不同時間組加入含10 μmol/L PDTC的完全培養液培養不同時間。并設未經干預的為空白對照。

NFκB/p65、Pgp免疫化學染色圖像分析

NFκB/p65和Pgp的檢測按SABC試劑盒說明書進行。以未經復染的細胞滴片為分析對象，由同一個觀察者在每張細胞滴片中隨機選取6個高倍視野（×400），總共至少100個細胞，應用圖像分析儀，確定灰度后，NFκB/p65染色片對每個視野的細胞進行灰度值檢測，Pgp染色片對每個視野的細胞漿進行灰度值檢測。灰度值越高，表達量越低。

mdr1 RTPCR檢測

總RNA的抽提、RNA逆轉錄及PCR反應按試劑盒說明書操作。PCR擴增反應產物進行電泳，電泳條帶深淺通過掃描后灰度分析，進行目的基因表達的半定量分析，以mdr1 cDNA/β2MG cDNA的灰度比值評價mdr1mRNA的表達水平。灰度值越高，PCR產物越多。

統計學方法

全部數據經SPSS 11.5統計軟件進行統計分析，數據用均數±標準差（±SD）表示。多組間比較采用方差分析，兩變量的相關程度用Pearson直線相關分析法分析。以雙側α=0.05為顯著性檢驗水準。

結果

K562/A02細胞經不同濃度PDTC作用12小時后，在P值為0.05水平上，除了個別相鄰兩組之間沒有顯著性差別外，其余各組之間NFκB/p65、Pgp 、mdr1/β2MG的灰度值都有顯著性差別。而且根據均數可知，濃度較高的一組NFκB/p65、Pgp的灰度值高于濃度較低的一組，mdr1/β2MG的灰度值低于濃度較低的一組，也就是NFκB/p65、Pgp、mdr1mRNA的表達量低于濃度較低的一組（表1、圖1）。眾所周知，Pgp表達受mdr1 mRNA的編碼，且兩者的表達有一致性。本實驗不同濃度組中兩因子的Pearson直線相關分析，Pgp的表達和mdr1mRNA的表達呈負相關，但Pgp的灰度值越大代表表達量越低，而mdr1灰度值越大代表表達量越高，所以兩者的表達是正相關(表2）。

經Pearson直線相關分析法分析，不同濃度組中，K562/A02細胞中NFκB/p65的表達和Pgp的表達呈正相關，和mdr1mRNA的表達呈負相關，但NFκB/p65和Pgp的灰度值越大代表表達量越低，而mdr1灰度值越大代表表達量越高，所以K562/A02細胞中NFκB/p65的表達和mdr1 mRNA的表達、Pgp的表達均呈正相關，結合多組間方差檢驗的顯著性差異可知，由于NFκB抑制劑PDTC作用濃度的增加，隨著NFκB/p65表達的不斷減少，Pgp和mdr1 mRNA的表達也在逐漸降低（表2）。

K562/A02細胞經10 μmol/L PDTC作用不同時間后，在p值為0.05水平上，除了個別相鄰兩組之間沒有顯著性差別外，其余各組之間NFκB/p65、Pgp 、mdr1/β2MG的灰度值都有顯著性差別。而且根據均數可知，作用時間較長一組NFκB/p65、Pgp的灰度值高于作用時間較短的一組，mdr1/β2MG的灰度值低于作用時間較短的一組，也就是作用時間較長一組NFκB/p65、Pgp、mdr1mRNA的表達量低于作用時間較短的一組（表3、圖2）。

Figure 2. Gel electrophoresis of mdr1 in K562/A02 cells treated with PDTC of different time. M: DNA marker. Lane 1: group 1. Lane 2: group 2. Lane 3: group 3. Lane 4: group 4.

同理，不同時間組中，經Pearson直線相關分析法分析，K562/A02細胞中NFκB/p65的表達和mdr1 mRNA的表達、Pgp的表達也均呈正相關，而且結合多組間方差檢驗的顯著性差異可知，由于NFκB抑制劑PDTC作用時間的延長，隨著NFκB/p65表達的不斷減少，Pgp和mdr1 mRNA的表達也在逐漸降低（表4）。

討論

隨著化療方案的改進、支持治療的加強以及干細胞移植技術的廣泛應用，白血病的治療效果已明顯改善。然而，多藥耐藥性的產生則成為目前部分白血病患者不能獲得緩解，或緩解后復發的主要原因。國內外許多學者通過在體外用藥物誘導耐藥細胞和建立耐藥表型動物模型，已發現多種耐藥機制： ①各種膜糖蛋白的外排泵作用引起細胞內藥物濃度下降，包括mdr1基因編碼的Pgp［2］、MDR相關蛋白MRP［3］、P110巨大拱形蛋白LRP［4］、乳腺癌耐藥相關蛋白BCRP［5］；②酶系統的作用，包括TOPⅡα表達下降［6］，藥物代謝酶系統P450、GST、GSH、GSHPX、SOD表達增高，此外，還有DNA損傷修復酶、DNA聚合酶、O6烷基鳥苷DNA烷基轉移酶以及熱休克蛋白的改變等［7］；③激素受體量和親和力的改變；④凋亡機制的修飾［8］。在血液腫瘤中，已被證實的最重要的多藥耐藥機制是mdr1 mRNA以及其產物Pgp的高表達，本實驗即是通過探討一條新的途徑抑制mdr1，實現逆轉耐藥。

核因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質。它可調控多種基因，如細胞因子、黏附分子、趨化因子、免疫因子、氧化應激相關酶、轉錄因子等。因而，它可以發揮多種生物學功能，包括參與炎癥免疫反應，調節細胞的凋亡，自身的轉錄，細胞周期調控，腫瘤的發生及耐藥等。Ogretmen等［9］證明，在MCF7細胞中NFκB可調控人mdr1啟動子活性。并有報道在鼠肝癌細胞中胰島素誘導的mdr1的表達是被NFκB介導的。最近有文章報道NFκB參與了肝細胞中TNFa誘導的mdr1的表達［10-12］。另有報道，對NFκB活性的抑制，減少了mdr1的表達，增敏了結腸癌細胞對柔紅霉素的敏感性。這一結果通過調控mdr1基因的表達提供了NFκB和化療耐受之間的一個新的聯系。但這一機制在白血病和淋巴瘤中是否存在仍需進一步證實。

本研究針對NFκB是一種氧敏感轉錄因子，能夠直接被活性氧介質（reactive oxygen species，ROS）激活這一特點［13］，選擇抗氧化劑二硫氨基甲酸酞吡咯烷（PDTC）抑制NFκB的活化。Lauzurica等［14］證實，NFκB抑制劑PDTC能阻止IκB的降解，同時也可以阻礙NFκB的P65、P50亞基向細胞核的轉移，從而發揮抗NFκB的作用。

本實驗發現，當PDTC作用于NFκB時，mdr1、Pgp與NFκB呈正相關，即隨著作用濃度的增加或作用時間的延長，mdr1mRNA、Pgp的表達也在逐漸減弱。Bentires等［15］證實，多藥耐藥基因（mdr1）啟動區域的第一外顯子包含1個純化的NFκB結合序列(5'CCTTTCGGGG3')，而NFκB也的確能夠激活連接mdr1啟動子的報告基因轉錄。由此可見，在白血病耐藥細胞株K562/A02中NFκB可以激活mdr1從而使pgp表達增加，pgp通過自身膜蛋白泵作用外排多種化療藥物，減少腫瘤藥物的吸收引起耐藥。但是否存在一個PDTC最適的作用濃度和時間，使其調控mdr1基因的作用最強，該結論還需要作進一步的研究。

基于以上NFκB調控mdr1的研究，今后我們可以探索利用多種已知作用于NFκB不同激活途徑的藥物來抑制mdr1，達到影響腫瘤的生存，提高化療或放療的敏感性，并同時希望能減輕治療的毒副作用的目的。

但是，血液腫瘤的耐藥是多因素的，腫瘤細胞可隨誘導藥物、細胞種類、分化階段和腫瘤細胞所處的微環境等條件的不同，而表現出不同耐藥表型，既可以是某一耐藥基因表達，也可以是多種耐藥基因同時表達。因此，我們應探索和發現更多新的耐藥基因，為血液腫瘤耐藥的診斷和治療提供更多的指標和靶點，以提高診斷準確率和治療效果。

根據本實驗應用NFκB的抑制劑可以抑制mdr1、Pgp的表達這一結果，是否可以探討一種或多種藥物或方法同時阻斷多種耐藥機制，從而達到高效逆轉耐藥的目的，這還有待今后進一步的研究。