作者：陳英玉， 鄭合勇， 胡建達， 鄭志宏， 鄭靜， 連曉嵐， 呂聯煌

【摘要】 本研究探討中藥大黃素（emodin）對人白血病耐藥細胞株HL60/ADR的增殖、凋亡影響及其相應的可能作用機制。采用MTT法繪制細胞生長曲線；集落培養法觀察大黃素對HL60/ADR克隆形成的影響；細胞周期分析、線粒體跨膜電位檢測、Caspase3酶活性檢測、Annexin V FITC/PI法、TdT酶介導的原位缺口末端標記法(TUNEL)分析凋亡細胞；RTPCR及Western blot法檢測大黃素作用后不同時間段bcl2、cmyc mRNA及Bcl2、cMyc、Caspase3前體蛋白表達水平的變化。結果表明， 大黃素對HL60/ADR細胞增殖具有明顯的抑制作用，呈時間和濃度依賴性。較低濃度大黃素即可抑制HL60/ADR細胞集落形成，IC50值為5.79 μmol/L。細胞周期分析顯示，與對照組比較，40、80 μmol/L濃度組細胞被阻滯于G0/G1期比率明顯增高（p< 0.01），G2/M期細胞比率降低（p<0.01），而20 μmol/L濃度組細胞周期改變差異不具有顯著性（p > 0.05），各濃度組均檢測到典型的亞二倍體峰（凋亡峰）。大黃素作用12小時HL60/ADR細胞線粒體跨膜電位降低，Annexin V FITC/PI法檢測到早期凋亡細胞，作用24小時caspase3酶活性顯著升高，作用48小時TUNEL法檢測到晚期凋亡細胞，細胞凋亡率呈藥物濃度依賴性。大黃素作用HL60/ADR細胞不同時間段，bcl2、 cmyc mRNA 和Bcl2、cMyc、Caspase3前體蛋白表達水平均有不同程度下調，并呈時間依賴性。結論 ：大黃素能夠有效抑制HL60/ADR細胞增殖，并誘導其凋亡， bcl2、cmyc表達水平下調，線粒體跨膜電位水平降低和caspase3激活可能參與了該過程。

【關鍵詞】 細胞增殖

Inhibitory Effects of Emodin on Drugresistant HL60/ADR Cell Proliferation and Its Induction of Apoptosis

AbstractThe study was aimed to investigate the effects of emodin on the proliferation and apoptosis of adriamycinresistant HL60/ADR cells， and to explore the underlying mechanism. The cell viability and colony formation were detected by MTT assay and colony formation assay respectively. Apoptotic cells were tested by means of cell cycle analysis，mitochondrial transmembrane potential levels， caspase3 activity detection， Annexin V FITC/PI staining and TUNEL labeling. RTPCR was used to analyze the bcl2 and cmyc mRNA expressions. The protein expressions of Bcl2，cMyc and caspase3 precursor were determined by Western blot. The results showed that HL60/ADR cell growth was significantly inhibited by emodin in dose and time dependent manners. Cell colony formation obviously decreased with IC50 5.79 μmol/L. G0/G1 phase cell population increased while G2/M phase cells decreased in 40 and 80 μmol/L groups compared with control group （p<0.01）， and no significant difference of cell cycle was observed in 20 μmol/L group（p> 0.05）. The typical hypodiploid peak (apoptotic peak) appeared in each dose group. The levels of mitochondrial transmembrane potential of HL60/ADR cells decreased and caspase3 activity increased when incubated with emodin for 12 and 24 hours respectively. Apoptosis occured in a dosedependent manner，and its earlier and later stages were identified by AnnexinV FITC/PI staining and TUNEL labeling methods respectively. The expressions of bcl2，cmyc mRNA and Bcl2，cMyc，caspase3 precursor protein were all downregulated in a timedependent manner after treatment with emodin at different times. It is concluded that emodin efficiently inhibits growth and induces apoptosis on HL60/ADR cells， which may be related with the downregulation of mitochondrial transmembrane potential and expressions of bcl2 and cmyc， as well as upregulation of caspase3 activity.

Key wordsemodin; HL60/ADR cell; proliferation; apoptosis

J Exp Hematol 2007; 15(5):955-960

大黃素（emodin），化學名稱為6－甲基－1，3，8－三羥基蒽醌，是從大黃屬、鼠李屬、蓼屬和番瀉葉等中藥中提取的一種蒽醌類單體化合物。研究表明，大黃素能夠抑制包括神經外胚層腫瘤、肺癌、肝癌、髓系白血病等多種腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡［1-5］，具有明顯的抗腫瘤活性，但對人白血病耐藥細胞株HL60/ADR作用的研究未見國內外文獻報道。本研究通過多種檢測方法觀察大黃素在不同作用濃度和不同作用時間下對HL60/ADR細胞增殖、凋亡的影響，并對其中可能涉及的機制進行了初步探討。

細胞株及試劑

HL60/ADR是由阿霉素誘導的人白血病耐藥細胞株，引自中國醫學科學院血液學研究所。大黃素為南京青澤醫藥科技開發有限公司產品，溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成50 000 μmol/L的母液濃度，-20℃保存。

細胞生長的MTT法測定

HL60/ADR細胞的初濃度為2.0×105/ml，接種于96孔培養板（Costar）。實驗組分別含10、20、40 μmol/L大黃素，對照組含與最高濃度組等量的DMSO。每組重復3個平行孔，每孔100 μl。用藥24、48、72、96和120小時后，每孔加入5 mg/ml MTT(Sigma公司產品)10 μl，繼續培養4小時后，小心地吸去上清，每孔加入100 μl DMSO，在酶標儀（STAT FAX2100型）上充分震蕩混勻，進行雙波長492 nm和630 nm比色，測定吸光度值（A值），繪制HL60/ADR細胞增殖曲線。

集落形成試驗

收集細胞接種于24孔培養板（Costar），分為對照組和1.25、2.5、5、10和20 μmol/L 5種濃度大黃素加藥組。每組重復3個平行孔，每孔接種200個細胞，總體積1 ml，并含0.7%的甲基纖維素，常規培養10天后倒置顯微鏡下計算細胞數。大于40個的細胞團為1個集落，對照組集落形成率大于40%者實驗有效。集落形成率=（各組集落數/200）×100%；集落形成抑制率=（1加藥組集落數/對照組集落數）×100%。以藥物濃度對抑制率做線性回歸計算IC50值［6］（IC50值為集落形成抑制率達到50%時的藥物濃度）。

線粒體跨膜電位改變檢測

收集對照組和20、40、80 μmol/L大黃素加藥組作用12小時的細胞，按照MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測試劑盒（Biovision）說明書進行操作，其具體步驟為：加1 μl MitoCapture Reagent到1 ml 37℃預熱的孵育緩沖液中充分混勻后，13 000×g離心1分鐘取上清，將約1.0×106細胞沉淀團重懸于該上清液中，于37℃、5% CO2溫箱孵育1520分鐘，離心棄上清，細胞沉淀團重懸于1 ml 37℃預熱的孵育緩沖液中，立即在流式細胞儀（BD FACScan）上檢測結果。

早期凋亡細胞的Annexin V FITC/PI檢測

收集對照組和20、40、80 μmol/L大黃素加藥組作用12小時的細胞，按照Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒（Beckton Dickinson）說明書操作。用1×binding buffer調整細胞濃度為1.0×106/ml，吸取100 μl到另一EP管，加入5 μl FITC和5 μl PI試劑，輕輕混勻，室溫放置暗處15分鐘，再加入400 μl 1×binding buffer，在1小時內進行流式細胞儀分析。

Caspase3酶活性檢測

20、40、80 μmol/L大黃素作用24小時后收集對照組和各藥物組細胞，按照CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase3 Staining Kit(Biovision)說明書進行操作。從1.0×106/ml濃度的細胞懸液中吸取300 μl，加1 μl FITCDEVDFMK， 于37℃、5% CO2溫箱孵育0.5-1小時，離心棄上清，將細胞重懸于500 μl工業 Wash Buffer，離心，再重復后者1次，最后將細胞重懸于300 μl Wash Buffer，置于冰上，進行流式細胞儀分析。

細胞凋亡的TdT酶介導的原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測

采用DeadEndTMColorimetric TUNEL System 試劑盒（Promega），其步驟如下：收集對照組和20、40、80 μmol/L大黃素加藥組作用48小時后的細胞，涂片，干燥后用4%低聚甲醛固定，0.2% TritonX100滲透細胞，緩沖液平衡后，滴加TUNEL反應液，置于濕盒內，37℃孵育60分鐘，2×SSC終止反應，0.3% H2O2去除內源性過氧化物酶，再與辣根過氧化物酶連接的抗體反應，加DAB底物，顯色。鏡下觀察細胞核染成棕褐色者為凋亡細胞，計數1 000個細胞，計算陽性率。

細胞周期分析

收集20、40、80 μmol/L各組藥物作用48小時后的細胞及對照組細胞，按Cell Cycle Test Plus DNA Reagent Kit（Beckton Dickinson）說明書操作。先用1 ml Buffer Solution 重懸細胞，重復3次，調整細胞濃度為1.0×106/ml，加250 μl Solution A 混勻后室溫孵育10分鐘，再加入Solution B 200 μl，室溫孵育10分鐘，最后加200 μl Solution C，混勻，冰上孵育10min，進行流式細胞儀分析。

bcl2、cmyc mRNA表達變化的RTPCR檢測

收集對照組和40 μmol/L大黃素作用12、24、48、72小時后的細胞，用TRIZOL試劑（Life Technology）提取總RNA，取2 μg反轉錄成cDNA，以βactin為內參照進行PCR擴增。βactin上游引物：5'GGCATGGGTCAGAAGGATTCC3'，下游引物：5'ATGTCACGCACGATTTCCCGC3'，擴增產物為500 bp。bcl2上游引物：5'CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC3'，下游引物：5'CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC3'， 擴增產物為318 bp。反應條件：94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環，最后延伸7分鐘。cmyc上游引物：5'TCCTGGCAAAAGGTCAGAGT3'，下游引物：5'GTTGTGTGTTCGCCTCTTGA3'，擴增產物為265 bp。反應條件：94℃預變性5分鐘，94℃變性1分鐘，56℃退火45秒，72℃延伸30秒，共32個循環，最后延伸7分鐘。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀作條帶密度掃描。結果以目的基因和βactin條帶灰度值比值表示。

Western blot 檢測

收集對照組和40 μmol/L大黃素作用12、24、48小時后的HL60/ADR細胞，用PBS洗滌后加細胞裂解液提取總蛋白，經紫外分光光度儀（Beckman DU640）定量后，取各組等量總蛋白進行12％ SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉移至NC膜上；膜用封閉液封閉1小時，加鼠抗人Bcl2單克隆抗體、鼠抗人cMyc單克隆抗體、鼠抗人caspase3前體單克隆抗體及兔抗人βactin單克隆抗體(Santa Cruz公司產品)，4℃過夜，TBS洗膜后加辣根過氧化物酶偶聯的兔抗鼠或羊抗兔IgG抗體，于室溫孵育1小時，洗膜后顯色。檢測過程參照KPL公司蛋白檢測試劑盒說明書進行。

統計學處理

采用SPSS 11.5軟件包進行統計學處理。單因素方差分析比較各組間差異，結果以均數±標準差（±SD）表示。

結果

大黃素對HL60/ADR細胞增殖的抑制作用

不同濃度大黃素在不同作用時間對HL60/ADR細胞增殖具有明顯抑制作用，并呈時間和濃度依賴性，濃度越高、作用時間越長，細胞增殖抑制作用越明顯（圖1）。大黃素對HL60/ADR集落形成亦具有明顯抑制作用，IC50值為5.79 μmol/L（表1）。

線粒體跨膜電位的變化

藥物作用12小時后，對照組線粒體跨膜電位下降的細胞數很少，占0.51%； 20 μmol/L、40 μmol/L組分別為5.47%、15.90%；80 μmol/L組線粒體跨膜電位下降的細胞數明顯增多，占 52.44%（圖2）。

早期凋亡細胞的比率

大黃素作用HL60/ADR 12小時即可以檢測到早期凋亡細胞，20、40 μmol/L藥物組凋亡率為8.05%、23.70%， 80 μmol/L作用組的凋亡率最高，達到35.01%，而對照組僅2.12%（圖3）。

Caspase3酶活性

大黃素作用24小時對照組caspase3酶活性增高細胞數較少，占(2.30±0.38)%， 20、40和80 μmol/L組細胞caspase3酶活性依次增高，增高細胞數分別為（14.60±1.51）%、（27.12±5.56）%和（70.79±1.60）%，各加藥組與對照組比較差異具有顯著性（p<0.005）（圖4）。

晚期凋亡細胞的比率

大黃素作用細胞 48小時后，對照組僅偶見棕褐色晚期凋亡細胞，占(0.37±0.15)%。20、40、80 μmol/L加藥組均可見數量不等的棕褐色凋亡細胞，凋亡率分別為(10.47±1.08)%、(39.90±1.48)%和(60.73±1.80)%，與對照組比較均有顯著性差異（p<0.005）。

細胞周期分析

20、40、80 μmol/L大黃素作用HL60/ADR 48小時后，各組均可檢測到亞二倍體峰(凋亡峰)，隨藥物濃度增加，細胞凋亡率也相應增高， 3個加藥組凋亡率分別為（8.05±0.45）%、（31.33±2.32）%和（48.57±6.43）%，80 μmol/L作用組48小時最高凋亡率可達到55.72%(圖5)。與未加藥對照組比較，40、80 μmol/L藥物作用組G0/G1期細胞增多（p<0.01）， G2/M期細胞減少（p<0.01），20 μmol/L 藥物組細胞周期的細胞數與對照組相比差異無顯著性（p> 0.05 ）(表2)。

大黃素對bcl2、cmyc mRNA和Bcl2、cMyc、caspase3前體蛋白表達的影響

大黃素對HL60/ADR bcl2、cmyc mRNA和Bcl2、cmyc、caspase3前體蛋白表達的影響呈時間依賴性，bcl2 mRNA、Bcl2蛋白表達水平在藥物作用12小時后即明顯低于對照組（p<0.01），作用時間越長，降低水平越顯著；而cmyc mRNA和蛋白表達12小時作用組與對照組比較差異無顯著性(p> 0.05)， 作用24小時后表達水平開始明顯降低（p<0.01）， 48小時作用組降低更明顯。caspase3前體蛋白表達水平在大黃素作用24小時后明顯低于對照組（p<0.01）（圖6、圖7）。

討論

白血病多藥耐藥（multidrug resistence，MDR）是指白血病細胞對結構、功能和殺傷機制不同的不同種藥物產生耐受，一旦細胞對某種藥物產生耐受，即可以對多種其它藥物耐受，是造成臨床白血病患者化療失敗的主要原因之一。目前應用藥物進行白血病MDR的研究報道較常見，如環孢素A、維拉帕米、蛋 白激酶C類抑制劑、氯丙嗪等，由于存在價格昂貴、毒副作用大、不宜長期應用等缺點限制了在臨床上的廣泛使用。我國學者應用浙貝母堿［7］、漢防己甲素［8］、三氧化二砷［9］等傳統中藥進行抗白血病MDR的研究已取得了可喜成績。大黃素是從多種中藥中提取的一種蒽醌類單體化合物，其抗腫瘤活性已被國內外學者所證實，Pecere等［1］通過體內外研究表明，大黃素能夠對神經外胚層腫瘤選擇性地產生毒性作用，抑制腫瘤細胞生長。Wang等［2］研究發現，大黃素是人肺腺癌細胞系CL5 Cyt P450 1A1和1B1 mRNA及蛋白質表達的誘導劑，而Cyt P450表達上調，提示線粒體PT通道開放，可導致CytC釋放，引發腫瘤細胞凋亡效應。將大黃素作用于白血病MDR細胞及相應分子機理研究卻未見報道，針對凋亡抑制是MDR發生機制中的一個重要原因，本研究選擇阿霉素誘導的多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistenceassociated protein ，MRP）高表達的人白血病細胞株HL60/ADR作為研究對象，探討大黃素對HL60/ADR細胞增殖及凋亡的影響，并分析其中可能涉及的作用機制，為該藥今后臨床應用提供理論基礎。

本研究結果表明，大黃素能夠明顯抑制HL60/ADR細胞增殖，呈時效和量效關系，較低濃度大黃素即可以抑制HL60/ADR細胞集落形成，IC50值為5.79 μmol/L。大黃素作用48小時后，細胞周期分析可見典型的亞二倍體峰（凋亡峰），G0/G1期細胞比例明顯高于對照組。以上結果提示，大黃素抑制HL60/ADR細胞增殖可能是通過抑制DNA合成，主要作用于HL60/ADR細胞的G0/G1期，從而阻滯細胞周期的進程來實現。集落形成試驗結果進一步顯示大黃素的細胞增殖抑制效應，同時也表明其對HL60/ADR細胞可能具有較強的抑制作用，提示該藥具備較好的臨床抗腫瘤應用前景。通過細胞凋亡檢測發現，大黃素作用12小時，線粒體跨膜電位降低的細胞數明顯增加； Annexin V FITC/PI 法證實，大黃素可以誘導早期細胞凋亡，作用24小時后caspase3酶活性升高的細胞數顯著增多；作用48小時，TUNEL 法從形態學觀察到典型的晚期凋亡細胞，并且細胞凋亡率呈現明顯劑量依賴性，藥物濃度越高，細胞凋亡率也越高，這說明大黃素能夠有效誘導HL60/ADR細胞凋亡。

細胞凋亡是由多因素引起、多分子參與的復雜過程。cmyc是一個重要的細胞原癌基因，主要通過基因擴增和染色體易位重排激活，表達產物為分子量約67 kD的序列特異性DNA結合蛋白，與細胞增殖、分化、凋亡密切相關，在髓性白血病細胞中存在高表達，本課題組前期研究發現，cmyc在大黃素誘導HL60細胞凋亡過程中發揮重要作用［5］。bcl2是一個重要的抗凋亡基因，又是目前已知的與腫瘤耐藥密切相關的耐藥基因，臨床上大部分血液系統腫瘤存在bcl2的高表達，從而導致患者對放療和化療產生耐受。bcl2位于線粒體內膜，在維持線粒體跨膜電位中發揮重要作用，可通過干擾Cyt C的釋放，阻止caspase的激活。線粒體依賴性凋亡通路是細胞凋亡的主要途徑之一，而細胞凋亡主要途徑的中心環節就是caspase 的級聯激活反應，其中caspase3是該級聯反應的關鍵效應分子［10］。Asakura等［11］認為MDR細胞具有對線粒體損傷的敏感性，直接損傷線粒體將誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，cmyc和 bcl2均高表達的HL60/ADR細胞在大黃素作用后，兩種基因的mRNA和蛋白表達水平均有明顯的下降，呈時間依賴性，作用12小時即可觀察到線粒體跨膜電位下降細胞數明顯增加，bcl2表達水平開始下調，作用24小時cmyc、caspase3前體表達下調，作用時間越長，表達水平越低，這表明大黃素可通過抑制bcl2、cmyc的表達，促進caspase3的剪切活化，從而誘導HL60/ADR細胞凋亡，線粒體途徑可能參與了該過程。

【參考文獻】 1Pecere T， Gazzola MV， Mucignat C， et al. Aloneemodin is a new type of anticancer agent with selective activity against neuroectodermal tumors. Cancer Res， 2000;60:2800-2804 2Wang HW， Chen TL， Yang PC， et al. Induction of cytochromes P450 1A1 and 1B1 by emodin in human lung adenocarcinoma cell CL5. Drug Metab Dispos， 2001;29:1229-1235 3Kuo PL， Lin TC， Lin CC. The antiproliferative activity of aloneemodin is through P53dependent and P21 dependent apoptotic pathway in human hepatoma cell lines. Life Sci ，2002;71:1879-1892 4Chen HC， Hsieh WT， Chang WC， et al. Aloneemodin induced in vitro G2/M arrest of cell cycle in human promyelocytic leukemia HL60 cells. Food Chem Toxicol，2004;42:1251-1257 5黃綠葉，胡建達，陳鑫基等. cmyc在大黃素抑制HL60細胞增殖及誘導凋亡中的作用.中華血液學雜志，2005;26:348-351 6蔣知儉．醫學統計學． 北京：人民衛生出版社，1998:138-140 7胡凱文，鄭洪霞，齊靜等. 浙貝母堿逆轉白血病多藥耐藥的研究. 中華血液學雜志，1999;20:650-651 8周云，陳寶安，董穎等. 漢防己甲素聯合屈洛昔芬逆轉K562/A02細胞耐藥與誘導凋亡相關性的研究. 中國實驗血液學雜志，2004;12:321-323 9許曉巍，許小平，陳少誼等. 三氧化二砷誘導多藥耐藥白血病細胞K562n/VCR凋亡. 白血病·淋巴瘤，2005;14:4-6